电子显微镜怎么选？SEM与TEM深度对比：工作原理、核心差异及应用场景

电子显微镜 （EM） 是一种出色的工具，它使生物学家能够以比光学显微镜更高的分辨率捕获样品图像。EM 有几种类型，每一种都可以提供有关样品的不同信息。

在本文中，我们将讨论两种主要电子显微镜技术的基础知识，它们可以为大家提供哪些信息，最后对它们进行比较。因为 EM 领域很大并且一直在扩大，所以有许多我们不会深入探讨的先进技术和工具。

电子显微镜的工作原理和关键术语

放大倍率和分辨率

在讨论显微镜的功能时，通常会使用“放大倍率”一词。然而，放大倍率并不是影响显微镜的主要问题，而是分辨率。分辨率是将两个对象区分为单独的能力。例如，一辆汽车在夜间向你驶来。最初，您会看到一个大灯。在某些时候，您将能够将灯光分成两个不同的大灯。这是最小可解析距离或分辨率。在显微镜中，我们指的是艾里斑，这是一种通过对点物体进行成像而产生的衍射图案。在显微镜中，两个物体的分辨率取决于它们是否足够分开，以便衍射图谱不会合并。这称为瑞利准则。

1873 年，恩斯特·阿贝 （Ernst Abbe） 能够确定显微镜可以达到的最佳分辨率，其方程式就是阿贝衍射极限。显微镜的设计旨在最大限度地减少变量，因此主要限制因素是用于对样品进行成像的波长。

所有类型的电磁辐射（例如，可见光、X 射线、无线电波等）都有一个特征波长。使用波长较短的电磁辐射可以提高可以实现的分辨率。例如，光学显微镜可以达到 ~200 nm 的最大分辨率，因为这大约是可见光的最短波长。事实上，200 nm 比蓝光的波长 （~400 nm） 短一点，但让我们不在这里讨论如何和为什么。超分辨率光学显微镜允许一些生物学家超过 200 nm，并且确实存在 X 射线显微镜。然而，EM 仍然是生物学家用于分子、病毒和细胞高分辨率成像的主要技术。

电子

电子是带负电的亚原子粒子，也具有特征波长。它们对两种电子显微镜技术都至关重要。电子的波长由德布罗意波长决定，在显微镜中，它与用于产生电子束的加速电压 （AV） 有关。例如，100,000 伏的 AV 导致电子波长为 0.0037 nm。这比可见光的波长短 ~100,000 倍。这反过来又提供了更高分辨率的样品图像（如下所述）。

虽然可以使用电子显微镜实现亚原子分辨率，但无法以这种分辨率对生物样品进行成像。尽管冷冻电子显微镜越来越接近，复杂的生物样品通常是限制因素！

电子显微镜技术：两种主要类型

EM 有两种主要类型。它们都有子技术，但两种主要类型是：

（一）透射电子显微镜 （TEM）。

（二）扫描电子显微镜 （SEM）。

它们之间的主要区别在于它们各自的光学元件（图 1）、信号的检测方式以及可以获得的信息类型。

两种类型的电镜都使用电子枪，其中包含电子源（产生电子云的细丝）、Wehnelt 圆柱体（形成电子束）和阳极（加速电子束）。电子源主要有三种类型：钨丝；六硼化镧 （LaB6） 晶体和场发射灯丝/枪。

TEM 和 SEM 都使用电磁透镜来聚焦电子束。电子沿磁场传播，可以像使用玻璃透镜聚焦光线一样聚焦，但使用其负电荷。镜头中有小孔径。这些是薄钼板，包含几个小孔，直径通常在 10-300 μm 范围内。在 EM 中，孔径用于控制光束的相干性，这会影响分辨率和信号中的对比度。

（一）透射电子显微镜

透射电子显微镜 （TEM） 是电子显微镜的原始形式。它开发于 1931 年，要求电子通过样品传输。高压电子束由阴极源发射，并由磁透镜控制。然后，该电子束通过薄样品部分传输。电子随后被样品衍射。然后，电磁透镜将光束重新聚焦为所选研究区域的衍射图的傅里叶变换图像。聚光镜（2-4 个，取决于显微镜）负责到达样品的照明量并控制光束强度或亮度。物镜将电子束聚焦到样品上并施加少量放大。中间透镜和投影仪透镜放大光束并将其投射到检测器上以形成最终图像，称为显微照片。

TEM 成像需要多长时间？

只需几秒钟即可获得显微照片。电子在显微照片中被检测为亮区，而较暗的区域出现在电子被样品散射或吸收的地方，这减少了到达相机或屏幕的电子数量。这被称为明场成像，是生物样品最常见的成像类型。

是什么让 TEM 显微镜更强大或更不强大？

按照惯例，TEM 通常根据它们能够实现的 AV 进行分类。用于生物成像的常规 TEM 应能够承受高达 120 kV 的 AV。大多数薄片 TEM 实验在 80-100 kV 下进行。先进的 TEM 技术可能需要能够承受 200 kV 至 3 MV 之间 AV 的仪器，这可以产生比光学显微镜高 ~ 2000 倍的放大倍率。这种极高分辨率是 TEM 通常用于观察样品表面内部或外部的内部原子特征（例如，内部特征、细胞器和大分子）的原因。

TEM 的局限性

TEM 的主要限制是它们会产生二维的黑白图像。此外，您无法对活体样本进行成像。这是因为，除其他外，将样品切成 10 纳米所需的处理非常苛刻，并且会杀死活样品。

（二）扫描电子显微镜

扫描电子显微镜 （SEM） 发明于 1942 年。与 TEM 不同，SEM 在任何时候都不会携带样品的完整图像。在 TEM 中，初级电子束中的电子通过样品传输，而 SEM 通过检测由于初级电子束激发而从样品表面发射的次级电子来生成图像。

哦，间的小能量转移产生的低能电子。正是这些电子被探测器拾取以产生最终的 SEM 图像。因此，SEM 的工作原理是用聚焦电子束快速扫描样品表面。这会导致电子从样品表面被敲落。这些是你的二次电子，是编码有关样品的信息。它们编码的信息示例包括表面地形和成分。您可以研究的样本类型包括家蝇的眼睛表面和人类内耳毛细胞。

SEM 样品需要溅射镀膜

此外，SEM 中的样品必须是导电的。然而，大多数生物标本本质上并不导电。为了克服这个问题，样品涂有一层薄薄的导电元素，如金。这个过程称为溅射镀膜。然而，要全面了解 SEM 需要比这更深入的理解。所以让我们来谈谈技术。

SEM 成像的工作原理

扫描电子显微镜将电子束聚焦到一个小点上，该点扫描样品表面。聚光镜将电子组装成超细光束，物镜将此光束聚焦到样品上。偏转线圈使光束沿矩形 X 和 Y 方向移动，从而在样品表面产生光栅扫描（因此进行扫描）。SEM 图像是由样品-光束相互作用产生的信号形成的。大多数生物 SEM 实验将使用两种类型的电子生成图像。我们已经提到的第一种电子。电子束和样品表面之间的能量转移导致轨道电子离开原子。这些是前面提到的二次电子。然后，当外轨道电子落入次级电子留下的间隙时，它会释放一些能量。第二种类型的电子称为背散射电子。这些是经过原子核附近并被反射或“反向散射”出样品的高能电子。

更复杂的是，有一些应用需要检测特征 X 射线。这些技术包括能量色散 X 射线光谱和阴极发光。如果这一切听起来很复杂，请不要担心。基本上，所有这些花哨的电子类型都起源于样品表面原子内的不同位置。由于它们具有不同的能量，因此它们在样品内的不同深度产生。检测到的电子类型决定了 SEM 实验和仪器的性质。

最后，SEM 图像的分辨率取决于光束撞击样品时的光斑尺寸以及光束与样品之间的相互作用体积。交互体积与光束的 AV 直接相关。生物 SEM 实验通常使用 1-5 kV 的 AV 以获得最佳分辨率。

（三）TEM 和 SEM 之间的异同

与 TEM 相比，SEM 图像是倒置的。图像的明亮区域是更多电子被散射的结果。但是，这两个图像都是灰度图像。相对较大的生物样品可以使用 SEM 成像，因为我们不再需要通过样品传输信号。

同样，由于 SEM 图像依赖于表面的电子相互作用，因此它可以对较厚的样品进行成像，并拥有更大的视深。两者都不能用于观察活体标本，因为整个显微镜（包括样品）必须处于真空中才能形成图像。

SEM 和 TEM 显微镜：（1）购买和维护成本非常昂贵。（2）需要稳定的高压和电流电源。（3）需要连续泵送的超高真空系统。（4）对振动和外部磁场非常敏感。（5）需要大量的样品制备。