总结：本文详细介绍了冷冻电镜断层成像（Cryo-ET）技术的核心体系，包括技术原理、核心优势与局限性，系统阐述了技术全流程——样品制备、数据采集、断层重建，以及子断层图像平均法（STA）的工作流程，同时提及相位板在衬度改善中的应用。
读者可系统到Cryo-ET技术的理论基础与标准化操作步骤，了解如何利用该技术解析细胞内原位大分子复合物的三维结构，为开展结构生物学、病毒学等领域的原位高分辨率研究提供全面的技术参考与实操思路。
在材料领域，透射电镜（TEM）已经可以观测到原子之间的排布。尽管TEM的放大能力非常强大，但并不是将细胞放在TEM下就能清晰地看到里面的细节。由于电子很容易受空气分子的影响，TEM的内腔需要保持近真空状态。而在真空中，细胞内的水分子会立即气化，导致细胞破裂消失。
因此，科学家们首先需要将细胞或其他生物样本迅速冷冻在极低温下，固定它们在那一刻的状态，然后才能进行冷冻电镜下的观察。这也解释了冷冻电子显微镜成像（cryo-electron microscopy，简称为cryo-EM）中“冷冻”（cryogenic，简写为cryo-）一词的含义。
除了需要冷冻外，生物样品在冷冻电镜领域的应用还受到另一个重要限制，即样品不能承受过多的电子辐照。过度的电子辐照会破坏蛋白质结构，导致冷冻样品局部受热并膨胀，甚至可能融化玻璃态的冰。因此，在冷冻电镜下观察生物样品时，只能使用较低的电子剂量。这就好比在漆黑的夜晚拍照时不使用闪光灯，照片会显得模糊。
https://www.thepaper.cn/newsDetail_forward_9813015结构生物学的下一个突破：cryo-ET
图1. 使用冷冻电镜解析的正二十面体型病毒的结构比较。T. S. Baker, Adding the third dimension to virus life cycles:Three-dimensional reconstruction of icosahedral viruses from cryo-electronmicrographs. Microbiol Mol Biol R 63, 862-+ (1999).
为什么需要cryo-ET？
D.Tegunov, L. Xue, C. Dienemann, P. Cramer, J. Mahamid, Multi-particle cryo-EM refinement with M; visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.7 Å insidecells. bioRxiv10.1101/2020.06.05.136341, 2020.
翻译参考资料Hong Y , Song Y , Zhang Z ,et al. Cryo-Electron Tomography:
The Resolution Revolution and a Surge of In Situ Virological Discoveries[J].Annual review of biophysics, 2022.DOI:10.1146/annurev-biophys-092022-100958.
图1：Cryo-ET填补传统显微及结构生物学技术的空白地带（Sai Li; Trends in Biochemical Sciences, 2022; 47(2): 173-186）
冷冻电镜断层成像（Cryo-ET）是一种从样品中重建三维信息的技术。与单颗粒技术SPA不同，这种技术通常在较大的样品、病毒或细菌等分离粒子或真核细胞上进行。Cryo-ET的力量在于可以实现一系列分辨率的细胞超微结构重构，因此它弥补了细胞和分子结构分辨率之间的差距。
冷冻的样品通过倾斜一系列角度，因此可捕捉到一系列的二维图像，这些图像可以通过计算组合来产生三维重建，这类似于CT扫描，只不过这里是样品被倾斜，而不是电子束被倾斜。
Cryo-ET的优点与不足
Cryo-ET的优点：1与所有的冷冻电镜技术一样，是在玻璃化的样品上进行成像，所以结构需尽可能接近于原始状态。2它将结构置于细胞环境中，提供细胞器之间的关系，以及细胞环境中分子的信息。3它可以揭示细胞环境中大型蛋白质复合体的不同结构和功能状态。
Cryo-ET也存在某些局限性：
备注：这种由于几何限制的“缺失楔形”问题，导致了沿着断层重建图中缺失信息的方向的延伸和傅立叶振铃伪影。缺失的楔形伪影会对断层扫描得到的表面原子结构的精度产生负面影响，是精确测定三维表面原子结构的主要障碍。
图2 来自 Ptk2 细胞冷冻电镜断层成像图，显示了丰富的内质体、多泡体、细胞骨架元素（包括肌动蛋白和微管）、核糖体和一些内质网。细胞位于碳膜上的一个孔中。图片由新南威尔士大学的 Nick Ariotti 提供。
在冷冻断层图中，高分辨率的分子结构也可以通过子断层图的平均化而得到阐明。从断层图中提取包含感兴趣的结构或分子的小的子图卷，进行对齐、平均，并通过迭代过程，获得高分辨率（nm）的三维重建。
图3 冷冻荧光显微镜。A. 使用冷冻荧光光学显微镜拍摄的 ptK2 细胞。该细胞表达荧光标记的微管相关蛋白 EGFP-DC。B. 同一细胞的冷冻电镜图像。C. 图像A覆盖在图像 B 上，因此可以看到微管在细胞内的位置。D. 细胞内相同荧光的高倍放大图像，显示细胞位于支撑碳膜的孔洞上方。E. 细胞位于碳膜孔上的高倍冷冻电镜图像。F. 冷冻荧光光镜图像叠加在冷冻电镜图像上，以识别包含相关微管的相关区域。图片由新南威尔士大学的 Nick Ariotti 提供。
采集Cryo-ET数据的硬件要求
大多数现代Cryo-TEM能够获取Cryo-ET数据，但有几个具体要求：
1一台300 kV场发射Cryo-TEM。由于样品相对较厚，而且在倾斜到高角度的过程中，样品相对于电子束变得更厚，所以300 kV的高电压是必要的。更高的电压使电子束的穿透深度（非弹性电子散射的平均自由路径）更大，电子散射更少。这比100和300 kV之间的穿透深度，增加了两倍。
2 能量过滤器是必要的，如单颗粒分析SPA部分所述，它可以通过去除非弹性散射电子来提高图像的信噪比。
3 一个非常稳定和经过良好校准的平台，可以倾斜到±60度或更大的角度。
4 需要一个在SPA研究中使用的剂量分化模式下运行的直接电子探测器，以提高信噪比并纠正图像漂移。
5 合适的电镜控制软件。软件主要是在采集倾斜数据时控制电镜，因为这是一个相对复杂的操作，在采集倾斜数据的过程中要控制许多参数。
相位板：改善断层图像衬度
除了基于离焦的方法，改善图像衬度的另一种方法是使用相位板。目前已经开发了三种类型来改善图像衬度。
1 最简单的是Zernike相位板，它是一层无定形碳的薄膜，中间有一个小孔，放在物镜的后焦平面。这允许非散射电子在没有相位的情况下通过，在透射波和散射波之间产生相对的相位变化，导致图像的衬度增强。不幸的是，随着时间的推移，由于污染的原因，这种仪器很容易退化，因此需要定期更换。它们还在图像中产生边缘伪影，并且由于对准问题而难以使用。
2 最常用的是Volta相位板（VPP），是一种无孔的非晶碳薄膜，也安装在后焦平面。这个薄膜板带电，产生静电势的变化，导致未散射的透射波相对于散射波的相移。由于无孔，Volta相位板不存在与Zernike相位板相关的问题。
3 基于激光的相位板涉及使用镜子将激光电子束放大数万倍，并利用这一点来引起相移。由于电子束路径中没有物理材料，因此不会有信息损失。这些技术仍在开发中，但显示了未来的巨大前景。
图6 相位板类型的比较。A. Zernike相板，利用碳膜上的孔产生相移。B. Volta相板，通过薄膜中的电变化产生相移。C. 激光相位板。强烈的激光束会产生相移。
由于不可能在所有的区域都达到完美的聚焦，所以仍然必须使用少量的离焦，这可以在数据处理中确定。
相位板有限的离焦使得衬度转移函数的拟合和校正变得困难。对于VPP来说，碳膜本身会引起电子散射，在所有的空间频率上会有大约20%的信号损失。然而，衬度的增强是有价值的，而且往往是观察断层图中小特征的唯一方法。因此，许多使用子断层图平均化的Cryo-ET研究使用相位板成像。
虽然最初用于小颗粒的SPA和冷冻断层成像以提高衬度，但现在已经证明，使用VPP无助于获得更好的分辨率，它们的使用越来越不普遍，特别是对于高分辨率的研究。然而，这一领域的新发展正在引起人们的兴趣，因此它们在未来可能成为一种更有价值的工具。
图7 使用 Volta 相板观察到的炭黑 A. 聚焦 B. 离焦-5µm 和 C. 聚焦。分别模拟 CTF。相位板的使用增加了图像的对比度，但对焦图像的 CTF 形状增加了图像校正的难度。图片由莫纳什大学 Georg Ramm 提供
Cryo-ET的样品准备
备注：金载网（Gold Grids）难与其他物质发生反应，但金有柔软性，易变形，尺寸不精确，且价格较高。有时做生物免疫电镜，为了避免生物细菌因铜中毒，而选择镍网或金网；
像病毒和细菌这样的样品足够薄，可以直接在TEM中成像。哺乳动物细胞的一些区域也足够薄，特别是在细胞的边缘。然而，大多数细胞需要变薄以使其成为电子透明。
用冷冻超微切片机（CEMOVIS）切割的冷冻切片已被用于Cryo-ET，但由于压缩伪影的限制，该技术没有被广泛使用。冷冻聚焦离子束（Cryo-FIB）铣削，可以制备一个仍在铜网上的细胞的薄化区域，现在常用此类技术。对于较厚的高压冷冻样品，也可使用Cryo-FIB，但必须从样品中取出变薄的薄片，并转移到专门设计的铜网上。
图8 通过Cryo–FIB 使生长在铜网上的细胞变薄的薄片示意图。细胞内的感兴趣区域（ROI） 保留为约200微米厚的薄片，而周围区域则用离子束去除。薄片仍由两侧的细胞残余支撑。
冷冻光镜可以是工作流程的一个重要部分，使用相关的定位信息，以便以后在细胞制备过程中或在TEM本身中找到ROI。
Cryo-ET的数据采集
虽然数据采集与SPA的程序有许多相似之处，但它也有几个具体的要求。
该工作流程包括获取铜网的低倍率图集，以定位感兴趣的区域。然后使用特定区域的中倍率图像来帮助确定值得收集数据的区域。当然，这应该以最小的电子剂量进行。
图10 冷冻断层成像的图像采集工作流程。A. 将装有玻璃化样品的铜网插入 Cryo-TEM。B. 以递增的倾斜角度（通常在+60°和-60°之间）采集图像。C. 然后使用叠加图像重建断层图。
倾斜数据收集包括四个步骤的重复过程：1倾斜，2跟踪/集中，3聚焦，4记录。
在低剂量成像中，跟踪和聚焦是在与记录区分开的区域进行的，以减少电子束损伤。
为了设定数据收集的参数，需要评估几个考虑因素。在开始一个项目之前，重要的是决定你需要的分辨率，以看到所研究的结构。许多基本的结构研究只需要较低的分辨率，但一个子图平均化项目将需要更高的分辨率。
1 放大率
这与分辨率直接相关。通过使用较小的像素尺寸，增加放大倍数将获得更高的分辨率。由于总的累积电子剂量是由每平方埃可使用的电子数量决定的，在较低的放大率下，每个像素可使用更多的电子，从而获得更好的信噪比。更高的放大率也会带来更小的视野，因此可能需要收集更多的断层图来获得足够的信噪比。这需要权衡分辨率与视野以及信号与噪声的关系。
2 电子剂量
总的电子剂量需要分布在整个倾斜范围内。不同的样品对电子照射有不同的敏感性。通常情况下，使用90-120e/Å2的累积剂量，在典型的61个倾斜角度中（±60度，2deg步长），每个倾斜图像的剂量为1.5-2e/Å2。所以每张图像的剂量非常低，导致信噪比降低。此外，在更高的倾斜角下，电子必须穿过更厚的样品，导致更多的散射，这也会降低信噪比。与SPA的单次曝光相比，使用的剂量要低10到20倍。这实际上是分辨率和信噪比之间的一个折衷。
图11. A厚度为T的倾斜剖面图。B.显示断面厚度T1(增加)倾斜断面图。
3 离焦设置
与SPA一样，这是一种平衡，在有更多的高频（或精细的细节）信息时，离焦较少，而在有低频（高衬度）信息时，离焦较高。由于信噪比低，在倾斜系列中，离焦通常被设置得很高（3-6µm）以提高衬度。
如何倾斜？倾斜策略包括三个部分：1.覆盖的总角度范围，2各个角度之间的增量，3收集倾斜图像的顺序。
覆盖的总范围通常与电镜中可用的最高范围一致，即±60-70°。以更细的角度增量收集将产生更多的数据，但需要将总剂量分布在更多的倾斜图像上，因此每个倾斜图像的信噪比降低。
有几种不同的采集顺序，现在最常见的是称为剂量对称。图像采集从倾斜范围的中间开始，然后交替着向两个方向越来越高的倾斜，震荡着增加角度。
首先在低角度进行采集的好处是，与随着倾斜而增加的样品厚度的低分辨率信息相比，这些信息包含更高的分辨率。等到收集到较高角度的时候，累积的电子剂量也会损坏样品。电子剂量的对称分布可以最大限度地减少尤其是在较高角度发生的对准跳跃。
图12 倾斜图像采集顺序示意图。这种剂量对称策略是交替采集正负角度的图像，先采集角度较小的图像。图中显示在 ± 60°之间采集了40个倾斜角度。
倾斜样品会导致样品的大量移动。这意味着需要在捕捉图像之间对样品进行自动对焦和跟踪。这是在与采集区域相邻的样品的另一个区域进行的。这个额外的步骤增加了采集的时间，所以经常是每隔几个角度才进行一次。现代电镜的设计已经改进，跟踪可能在所有情况下都没有必要，这意味着有可能在不到10分钟内收集完整的倾斜系列。
图13 由倾斜序列重建的断层扫描图像。成像是在小鼠胚胎成纤维细胞外围的薄层区域进行的。图像以+60°至-60°两度为单位采集。系列图片由莫纳什大学的 Georg Ramm 提供。
预处理、剂量加权和漂移校正程序纠正了图像采集过程中的漂移和失真，并改善了高频信号的损失。倾斜图像使用原样品中包含的胶体金标靶，相互之间完全对齐。然而，对于像Cryo-FIB薄片状样品，如果胶体金不能包含在样品中，则需要寻找高衬度的特征进行对准。
图14 根据冷冻电镜拍摄的系列倾斜图像断层重建图的工作流程。
由于成像是利用离焦的相位衬度进行，因此有必要进行衬转移函数（CTF）校正以恢复图像中的高分辨率信息。由于倾斜，样品中的物体处于相当不同的焦点，所以这使得CTF的拟合很困难。一个帮助解决这个问题的方法是将图像划分为多个斑块，以计算垂直于倾斜轴的离焦梯度。
然后，这些数据可以用两种主要方法进行断层重建：
1最简单的方法是基于SPA的中心截面定理。每个二维投影图像的傅里叶变换被置于三维傅里叶空间的一个平面中。结合所有的倾斜，然后对三维傅里叶变换进行反变换，以产生颗粒在真实空间中的三维重建。为此，我们需要知道二维投影之间的关系，即投影之间的角度和移位（来自电镜中倾斜系列设置的信息）。
图15 根据中心截面定理对投影图像的二维傅里叶变换进行对齐。这表明，中心区域的低频信息较多，而外围的高频信息较少。这就需要在重建时对信息进行不同的加权。可用倾斜角的数量有限，导致缺失楔形区域信息不足。
二维傅里叶变换像车轮的辐条一样排列着。在这个排列的中心区域，也就是对应于低频的区域，会有一个过度的信息呈现。然而，在外围，即高频区域，这些“辐条“的间隔较远，信息会丢失。倾斜角越大，这些之间的距离就越小，数据就越完整。这种信息的差异意味着有必要在重建中对倾斜图像进行相应的加权。这种重建方法被称为加权背投（WBP）。
另一种方法是模拟迭代重建（SIRT）。这产生了从一个估计的断层图投射出的射线，并将这些射线与倾斜图像中的数据进行比较，寻找每个像素的差异。利用代数计算，断层图被反复地改进，使用这些差异。这一过程将持续到选定的迭代次数。这可以得到一个更高衬度的断层图，并改善在“缺失的楔子“中丢失的信息，但速度较慢，而且会丢失更高的分辨率信息。正因为如此，WBP被用于高分辨率的研究，如子断层图的平均化。这些过程在几个可用的断层图重建软件包中都有。
图16 显示如何将样本的背面投影重建到断层扫描原始三维体积的示意图。
其中，分辨率为 r，D 为物体厚度，N 为投影（或倾斜角度）数。
图17 由倾斜序列重建的断层扫描图像。成像是在小鼠胚胎成纤维细胞外围的薄层区域进行的。图像以+60°至 -60°两度为单位采集。图片由莫纳什大学的 Georg Ramm 提供。
如何解读断层扫描图？
断层图是非常复杂的，包含很多拥挤的结构。信噪比很低，需要去噪过滤器来增强信号，使结构更加明显。然而，在重建过程中可能很难辨别单个物体，也很难看到它们的结构和它们与其他物体的关系。
分割是一种从周围细胞环境中选择感兴趣的结构的手段，被分割的结构和与其他被分割的对象的关系可以很容易地在三维中看到。分割包括围绕结构的轮廓进行绘制，将它们从断层图的其他部分中划分出来，并允许提取它们。它还能对数据进行全面的定量分析，给出体积、距离和其他可能的参数。
电镜和探测器的技术进步，使每天获得大量的倾斜图片成为可能。如此大量的数据很难进行注释和量化，手工分割是非常耗费人力的，因此许多程序被设计来帮助实现这一过程的自动化。卷积神经网络（CNN）被越来越多地用来进行深度学习，作为一种更自动化的分割手段。
子断层图平均法利用Cryo-ET产生的断层图来确定该断层图中颗粒的三维结构。如果结构存在于多个副本中，如蛋白质或多分子复合物，它们将被独立提取，然后对齐和平均，以提高信噪比并改善结构的可实现分辨率。
图18 MEF 细胞中线粒体的重建和分割断层图像。绿色为内膜，红色为外膜，蓝色为嵴，黄色为 ATP 合成酶。影片由莫纳什大学的 Georg Ramm 提供。https://myscope.training/
cryo-ET之外的策略：子断层图像平均法STA（sub-tomogram average）
子断层图像平均法类似于SPA，但这里的颗粒是以三维体积提供的，而SPA则是二维投影。其优点是，你不仅可以获得颗粒的结构，而且还可以找到它与细胞环境的位置和背景。
图19 子断层图像平均法的工作流程。将包含感兴趣粒子的子矩阵图提取为子矩阵图。然后将这些子矩阵图定向到一个参考平均值，并进行三维分类以生成一个新的参考值。这个过程反复进行，每次都会产生一个新的参照物，直到不再对参照物进行细化。 Briggs J.A.G. Curr. Opin. Struct Biol 2018 23, 261.
子断层图像平均法可以用于分离的纯化颗粒和细胞内的结构。虽然在大多数情况下颗粒可以被分辨到1-4nm，但最近的研究显示细胞内的颗粒的分辨率埃米，分离的颗粒的分辨率为2-4埃米。一些研究显示，使用SPA和子图谱平均法可以获得相当的分辨率，因此在未来，这种技术可以证明对结构生物学非常有用。
除了在Cryo-ET中面临的挑战外，子断层图像平均法的额外挑战是：
1.样品的灵活性和异质性。一般来说，通过子断层图像平均法检查的东西的类型比使用单颗粒分析的东西更加异质和灵活。SPA使用的是纯化的颗粒制剂，通常是相当均匀的，而在对细胞中的颗粒进行子图谱平均时，颗粒是自然出现在细胞中的。
2.需要两个对齐和重建步骤。所有的倾斜图像被对齐和平均以产生一个断层图，然后提取子断层图，并对这些断层图进行另一次对齐和重建。
3.较小的数据集。颗粒不会以SPA研究所用的纯化样品中的数量出现，特别是在细胞制备中。平均化通常是在较小的颗粒数据集上完成的。
当然，所有这些问题正在被硬件和软件的技术发展所解决，从而逐步提高重建模型的分辨率。
图21 嗜肺军团菌IV型分泌系统的平均子矩阵图，显示了该结构的背景以及它在细胞内外膜中的位置。这是沿黄色虚线连接的两个不同平均值的合成图。图片由墨尔本大学 Debnath Ghosal 提供。
子断层图像平均法的颗粒选取
第一阶段是在断层图中定位单个颗粒并定义其坐标。这方面已经使用了几种策略。
1 颗粒相对于一个支撑物进行挑选，例如，它们可以沿膜或丝状物排列。沿着支撑物的固定间距，颗粒可以被自动挑选。这也可以提供关于颗粒的初始方向角的信息。
2 使用模板进行自动挑选。如果模板不准确，这可能会带来偏差，特别是这些模板往往是低分辨率的，并取自其他数据。随着图形的改进，颗粒可以在一个迭代过程中被重新挑选。
3 使用经过训练的CNN神经网络进行挑选。
一旦挑选，子图被提取为三维方框体，用于进一步分析。虽然CTF校正是在构建断层图时进行的，但子断层图的三维CTF校正更准确，特别是在每个颗粒上进行校正时，考虑了每个断层图中每个颗粒的已知高度。
图22 嗜肺军团菌细胞透视图。从重建的体积中提取了IV型分泌系统结构（红圈）。图片由墨尔本大学 Debnath Ghosal 提供。
子图平均化和对齐
与SPA一样，在子断层图平均化工作流程中，有一个迭代执行的对齐和平均化程序。一组子断层图与一个参照物对齐，以获得最佳拟合。然后，对准的子图进行平均，产生一个新的结构，然后作为下一轮对准的参考，这将是一个迭代的过程。初始参考可以由其他信息产生，或者由其他信息产生一个形状。
子图和参照物之间的配准是通过遮蔽和旋转参照物来进行的，与每个子图进行比较，给出一个由交叉相关函数决定的分数。由于子图平均化使用的是三维数据，因此在这个方向排列中必须使用三个移动方向和三个旋转轴。由于在原始数据收集中用于产生断层图的倾斜角度范围有限，每个子断层图都有一个 “缺失的楔形“信息。这可以通过在傅里叶空间的参照物上添加一个楔形掩码来补偿，因此子断层图总是与具有相同方向的“缺失楔“的参照物对齐。
通常情况下，数据会被分档以便更容易管理，第一次分析是在这种低分辨率下进行的。当达到每个分档的最大分辨率时，分档的数量就会减少，直到包含全部数据。
完整的数据集被分割成两个独立的数据集，分别进行对齐和平均。这最大限度地减少了高频信息的偏差和过度拟合。精细化的迭代过程一直持续到达到某种预定的收敛水平。
最大似然平均法也可用于通过使用不同方向的加权贡献来减少过拟合。
子图分类
在子图平均化过程中进行分类，目的是：识别在挑选步骤中过度取样的重叠或错位的子图谱，更重要的是找到并删除异质构象。这将产生一个更均匀的数据集。
通过现有的软件包可以实现几种分类策略。最简单的分类方式是基于对齐步骤的交叉相关值。通过为对齐的子图和参考图之间的交叉相关设置一个阈值，所有低于阈值的子图都会从数据集中删除。分类也可以用原理成分分析（PCA，Principal component analysis).）来完成。这种统计工具可以将数据中的复杂变量减少到一组较小的 “汇总指数“，可以更容易地进行可视化和分析，同时仍然尽可能地保留数据的变化（主成分分析）。这种技术避免了使用参考模板的偏差，但和交叉关联一样，这种技术对“缺失的楔子“很敏感。
最大似然法也可以使用，这些方法利用了连续的CTF校正子图。为了识别子图中的构象差异，用掩膜覆盖结构中的特定区域可以产生特定区域的分类。
虽然所描述的工作流程是按照断层图的重建、提取、平均、排列和分类一个一个进行的，但许多软件程序可以同时处理其中的许多步骤。
模型完善和验证
SPA中遵循的很多程序也适用于子断层图的平均化。包络函数以同样的方式抑制了高频信息，因此必须使用 “B因子“来锐化三维重建。这里的B因子通常比SPA高，因为颗粒可能是相当异质的，而且高倾斜角意味着低分辨率的信息被大量过度表现。重新加权策略可能也是必要的，以克服低频的代表性不足和不均匀的离焦。
同样，正如在SPA细化中执行的那样，使用了黄金标准细化程序。数据半组被细化并相互对齐，以得到一个相关度，即傅里叶壳相关度（Fourier Shell Correlation，FSC）。在单颗粒分析介绍中，给出了关于FSC的完整描述。这为每次迭代提供了一个结构分辨率，新产生的参考应该根据这个分辨率进行低通过滤。低通过滤器削弱了高频（或更详细）的信息。
图形验证对于表明所创建的模型确实代表了真实的结构也很重要。与SPA类似的验证方法被使用，比如检查二级结构是否显示出预期的特征，并与其他方法制作的模型进行比较。一个好的验证手段是在其三维环境中检查结构。例如，它们是否沿着膜正确地坐着，或者重建的螺旋线的亚基是否真的分布在一起，形成螺旋线模式？
图23 嗜肺军团菌细胞膜内重建的 IV 型分泌系统局部分辨率图。图片由墨尔本大学 Debnath Ghosal 提供。
图24 通过对整个细胞中的结构进行子图谱平均，重建嗜肺军团菌的 IV 型分泌系统。图片由墨尔本大学 Debnath Ghosal 提供。
本文源自微信公众号：老千和他的朋友们
原文标题：《TEM专题 | 冷冻电镜断层成像（Cryo-ET）技术解读》
原文链接：https://mp.weixin.qq.com/s/w92FqLZ9l2bbIDuCUp-UYQ?scene=1
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