一文读懂生物透射电镜！

一、项目介绍

生物透射电镜是观察生物细胞样品内部形态的重要工具，其电压在80-120kv可以降低生物样品因高能电子束辐射而损伤的影响，同时依赖于生物样品制备技术的发展，如超薄切片技术、负染色技术、冷冻制样技术、细胞化学技术等，广泛应用于组织学、细胞学、病毒学、病理学及材料学等多个学科的研究中，一般用来观察细胞整体结构、细胞膜、细胞壁、细胞器等亚显微结构变化、材料进入细胞内部的分布情况或者细胞应付外界刺激产生的自噬小体等结构，以及外界生物入侵的侵染结构等。

二、样品要求

1. 送样要求

（1）细胞样品用1.5ml的尖底管，离心成团（至少黄豆大小），加入2.5%戊二醛固定液（固定液加满离心管，使样品完全浸没在固定液中），放置于4°C固定12h后，用泡沫盒加冰袋低温保存运输，注意：样本管与冰袋隔开，避免固定液结冰。（细菌样品要求同细胞）；

（2）组织样本：肠、血管、皮肤、肌肉等有方向性样本需切成1mm*3mm*0.5mm长方体小块（如下图B），要观察的面为横切面（1mm*0.5mm），使用2mL离心管加满2.5%戊二醛固定液；无方向性的组织，如肝脏、肾脏、肺脏等可切成1mm³立方体小块（如下图A），使用2mL离心管加满2.5%戊二醛固定液。放置于4°C固定12h后，用泡沫盒加冰袋低温保存运输。注意：样本管与冰袋隔开，避免固定液结冰。

图1：电镜样本的大小和形状

（3）打印填写完整的实验要求单和样品一起寄送；

（4）无法承接磁性样本，敬请谅解。

2. 取样建议

生物样品透射电镜取材注意事项：

取材是电镜实验的第一步，其操作成功与否直接关系到电镜结果的效果及成败。为了得到好的结果，请务必按要求做好取材！取材基本要点：快（1min）、冷（4℃）、小（1 mm³）、净（无杂质）、准（部位准确）。不同的样品，取材细节上有很大区别！取材部位准确，且注意观察组织的方向性和定位。动作轻巧，器械锋利，避免对组织的挤压和推拉，建议用锋利的手术刀片、手术剪刀。

（一）动物组织取材流程及要求

取材流程：动物麻醉或断头急性处死，解剖取出所需的器官或组织，生理盐水简单冲洗血液及组织液。按要求将组织切成1mm³左右小块，固定于组织及细胞电镜专用2.5%戊二醛固定液中。

固定方式有两种：

（1）浸泡固定：适用于一些能允许在短时间内停止供血而仍保持其功能和结构的器官或组织，以及一些病理检查的样品。其方法是经解剖（或手术）尽快从机体中取出所需组织，并按取材要求，把组织切成小块，放入小瓶子内作常规固定。

（2）血管灌注固定：适用于取材较复杂或对缺氧较敏感的器官或组织，须采用血管灌注固定。灌注固定一般通过供血的动脉进行，小动物也可经左心室或升主动脉穿刺，行全身灌注。可根据动物的大小选用全身灌注或局部灌注的方式。参考方法：首先用50毫升生理盐水（37℃）清洗血液，接着用50毫升固定液（37℃）快速灌注固定，然后用250-300毫升冷固定液（4℃）慢速灌入，持续10-15分钟后取材，置组织于同样固定液中，在4℃冰箱中固定，灌注液跟后面的固定液一样，使用2.5%的戊二醛。

具体取材要求

（1）位置：肝、肺、脾等无需定位组织取1mm³组织，3-5块；需要定位组织如骨骼肌、肾、肠、血管、胰岛等组织取材大小为0.5mm×1mm×3mm左右的长条状，且保证观察结构在组织块中。

（2）操作：试剂、容器、器械提前4℃预冷；组织离体后，1min内浸入戊二醛固定液。取材时，可提前准备一个载玻片（硬卡纸），滴几滴戊二醛固定液，把标本浸在液滴中修整至合适大小（时间可稍长），用牙签挑出3～5粒标本，放入1.5ml尖头EP管。将修整好的标本块放入戊二醛固定液后，普通4℃冰箱保存。

（二）细胞取材流程及要求

对于细胞、细菌样本取材，取好后需放入1.5ml离心管中（尖底），黄豆大或者绿豆大，根据细胞培养类型不同，取材方式不同。

1、悬浮细胞：轻微并短暂离心培养液后收集细胞，加入新鲜缓冲液，低温1000rpm/min（离心力不可过大，离心时间不可过长，避免机械挤压导致细胞变形，也可根据具体情况调整）离心5min，弃上清。滴加新鲜缓冲液重悬15min，低温1000rpm/min，离心5min，弃上清，重复2遍。敏感的细胞直接固定，不洗。样品加入4℃预冷戊二醛固定液后重悬，4℃固定过夜。

2、贴壁细胞：采用轻吹，刮刀；若用胰酶消化0.5min后立即加入血清终止（贴壁牢的肿瘤细胞，可以消化+刮刀），置于尖底1.5mL离心管中，滴加1小滴固定液立即混匀（勿使液体凝固），低温1000rpm/min离心5-10min，取上清（不清洗），沿管壁小心加满4℃预冷固定液，使细胞成团。

3、细菌：吸取OD0.5-0.8的培养物，离心后弃培养基，收集菌体沉淀于管底黄豆大小，可以用PBS洗1-2次，弃掉上清液，沿管壁缓慢加入4℃预冷的固定液，然后放入4°C冰箱保存。

4、固体培养：从培养基上刮取细胞群落，加入新鲜缓冲液，低温1000rpm/min离心5min后，弃上清。滴加新鲜缓冲液重悬15min，低温1000rpm/min离心5min，弃上清，重复2遍。样品加入戊二醛固定液后重悬，4℃固定过夜。

一文读懂生物透射电镜！

注意事项

（1）细胞数量充足（6cm或10cm皿长满），离心后在EP管中黄豆大小；

（2）缓冲液、戊二醛固定液等PH值7.3-7.4，4℃提前预冷；

（3）贴壁细胞连着培养基用细胞刮斜着快速刮下，不要反复来回刮；

（4）细胞悬液转入离心管，1000-3000rpm离心成团，弃上清，加PBS，将细胞转入1.5mL尖头EP管，再次离心后弃上清。再加PBS重复上述步骤，最后加2.5%戊二醛固定，4℃保存。操作轻柔，尽量保证细胞不散开。(转速及时间请结合细胞情况，尽量低转速、短时间，以细胞离心成团为准！（PBS 清洗时间过长，易造成细胞损伤)；

（三）植物组织取材及要求

取材流程：PBS冲洗样品，确保无泥沙等污染物。然后用锋利刀片或剪刀将样品切成合适大小，装入预冷的植物及细菌电镜专用2.5%戊二醛中。不需要定位的样品切成1立方毫米大小（如叶片、果实、花粉等），需要定位的样品，切成1mm×3mm×0.5mm的长条状（茎、根、表皮等）随后抽气，让组织能沉淀到管底。

注意事项：植物细胞的细胞壁和液泡会阻碍固定液迅速渗入。植物材料内部存有的空气，往往使材料漂浮于固定液面之上，由此影响到植物组织的固定效果。组织放入戊二醛固定液后，可用真空泵或者50ml的注射器抽出组织内部的气体或者用滤纸压住叶片，使材料沉入固定液中。简易抽气方法：将植物组织同固定液一起倒入注射器，用乳胶手套食指堵住注射器出口，右手拉动针栓，将注射器口垂直向上，松开食指，右手轻推针栓使液面上的气泡从注射器口排出，反复多次，直至组织沉入固定液。