扫描透射电镜（STEM）如何实现单原子成像，推动电子显微学革命

总结：本文介绍了扫描透射电镜（STEM）的发展背景、早期技术探索，重点阐述了Albert Crewe在STEM领域的开创性贡献——包括提出使用场发射电子枪（FEG）解决电子源亮度不足问题、设计新型磁透镜与环形探测器、首次实现单个重原子（如铀、钍原子）成像，同时提及 STEM 结合电子能量损失谱（EELS）在生物样品分析中的早期应用，以及像差校正技术对STEM分辨率提升的后续影响。

读者可学习到STEM从技术雏形到实现原子级成像的关键突破路径，了解场发射电子枪、环形探测器等核心组件的作用与价值，为理解现代电子显微学技术起源、把握原子级表征方法发展脉络提供全面的历史参考与理论支撑。

长期以来，人类一直对大自然及其运作方式着迷。好奇心和对了解自然的渴望推动了科学和技术的突破，从而不断提高我们的生活质量。我们通过感知来认识自然，其中视觉起着至关重要的作用。由于人眼的角度分辨率非常有限（约0.0003弧度），我们的肉眼既无法直接观察到微小的特征/生物，如单个的活细菌，也无法观察到遥远的星座中巨大的单个恒星。

为了更清楚地“看到“微小的特征，人们早期就开始制造眼镜和放大镜，并由此开发出了两种重要的科学工具：望远镜用于清楚地观察远处的事物，显微镜用于观察我们肉眼无法观察到的细小特征/生物。

早期的望远镜和显微镜都依靠玻璃镜片的独特性能来操纵光线。望远镜的不断改进极大地扩展了我们对宇宙的认识，而各种显微镜的发展则使我们能够直接观察细菌、病毒、分子甚至单个原子。望远镜和显微镜的发明揭开了大自然的无数神秘面纱，并促成了无数对我们日常生活产生积极影响的发现。

扫描透射电子显微镜（STEM）是目前广泛应用于原子尺度物质分析的一种特殊显微镜，本文旨在介绍这种显微镜的重大进展。虽然STEM早在1970年就被用于对单个金属原子进行成像（Crewe，1970年），但是经过了很长时间的发展，才能有效利用这种强大的表征方法。

通过对透镜像差进行校正，实现了亚埃级图像分辨率、以及皮米级精度和高化学灵敏度，极大地增强了STEM及其相关技术对许多研究前沿的影响。这一成就彻底改变了我们对原子层面物质的认识，并将对我们认识自然产生巨大影响。

最近，Harald Rose、Maximilian Haider、Knut Urban和Ondrej L. Krivanek”利用电子束进行亚埃级分辨率成像和化学分析“获得了2020年卡弗里纳米科学奖，这足以证明这一成就的重要性。

由于许多关于像差校正TEM主题的优秀综述已经出版（例如，Rose，2008；Hawkes，2009；Septier，2017；Hawkes& Krivanek，2019），我们将在这里重点介绍通过STEM形成高分辨率图像的进展，以及Albert Crewe的贡献。

1 光学显微镜简史和电子显微镜的诞生

荷兰眼镜制造商Hans Martens/Zacharias Janssen一般被人们认为发明了复式显微镜（Orchard & Nation, 2014），而另一位荷兰眼镜制造商Hans Lippershey则被认为是通过将凹面目镜与凸面物镜组装在一起而获得望远镜专利的第一人（Van Helden, 1977）。这些基于透镜的望远镜和显微镜的早期实际应用清楚地反映在它们各自的绰号中，即间谍眼镜和跳蚤眼镜。

1609年，Galileo Galilei建造了自己的望远镜，并发现月球并不是一个完美的球体；随后，他利用精心打磨的镜片对天体进行了科学观测，并发现了许多以前不为人知的遥远星系（Drake，2003年）。尽管现代詹姆斯–韦伯太空望远镜的造价可能超过100亿美元，但我们对宇宙的认识却是从两块玻璃镜片堆叠成一个简陋的望远镜开始的。

尽管科学显微镜的早期发展和应用难以准确追溯，但Robert Hooke在1665年出版的《显微镜》（Micrographia）一书中清楚地展示了使用复式显微镜观察人类肉眼无法观察到的微小特征的能力。Hooke还创造了“细胞Cell“一词，用来描述在复式显微镜下观察到的软木树皮结构。细胞的发现得益于显微镜的发明。由于抛光不良的玻璃镜片存在像差和其他相关问题，早期的复式显微镜无法在提供高倍率图像的同时避免图像严重失真。

另一方面，Antonie van Leeuwenhoek使用精细抛光的单玻璃镜片，能够在水环境中观察各种生物样品，甚至是微小生物的动态运动，放大倍率高达~300倍（Lane，2015年）。通过他精制的单透镜显微镜的广泛观察，Leeuwenhoek发现了自然界的许多秘密，如细菌、微小原生生物、精子细胞、血细胞以及微小线虫和轮虫。显微镜的发明使不可见的世界变得可见，并促成了许多发现，帮助我们更好地了解自然，创造了新的科学学科，并极大地提高了人类的生活质量。

为了了解显微镜的工作原理以及如何可靠地生产高质量的光学显微镜，Ernst Abbe提出了一种成像理论，并确定了光学显微镜的分辨率极限：由于衍射效应，光源的波长控制着光学显微镜最终可达到的图像分辨率，大约为光源波长的一半（Abbe，1873 年）。即使镜头像差得到完美校正，光显微镜的最高分辨率也只能达到约 200 纳米。这样的理论限制阻碍了对更小尺寸的亚细胞结构的清晰观察。

早期试图通过扫描局部光探针来克服图像分辨率障碍的工作并不十分成功（Synge，1928，1931，1932）。1957 年，Marvin Minsky申请了一项专利，描述了构建共焦扫描显微镜的新方法。随后，在Minsky的设计中加入了激光束（Davidovits & Egger, 1969, 1971），并使用荧光标记对生物系统进行三维（3D）检测（Cremer & Cremer, 1978），大大提高了图像分辨率，使光学切片的三维成像成为可能（Wilson, 2011）。

通过使用创新方法生成和检测荧光信号，超分辨显微镜的最新发展得到了更快的计算机、高质量激光器、荧光团以及图像采集和处理算法的极大帮助，证明了超分辨显微镜在对生物物体成像方面取得了巨大成功，其图像分辨率小于20纳米（可提高到~1纳米），从而能够在生理相关环境下观察亚细胞系统的动态运动。

根据 Abbe 的理论预测，使用更短的波长应能提高图像分辨率。de Broglie提出了物质波的假说（de Broglie, 1923），随后Davisson和Germer通过实验明确验证了电子的波特性（Davisson & Germer, 1927），Busch理论预测可以使用圆柱形磁透镜聚焦电子（Busch, 1926），类似于光被玻璃透镜折射的方式，这些都导致了基于电子而非光的新型显微镜的出现。

Ruska和Knoll大胆冒险，利用波长比可见光短得多的金属尖端发射的高能电子，制造了一种新型显微镜（Ruska & Knoll, 1931）。随着电子光学技术的不断完善，这种电子显微镜可以轻松提供比任何当代光显微镜都要好得多的图像分辨率。由于带电电子会被分子强烈散射，因此需要一个高真空室来放置电子枪、相关样品和记录介质。

利用电子而不是光来形成物质图像，可以获得图像分辨率不断提高的物质图像，从而极大地增强了我们对微观和纳米世界的了解。

(a)显微镜分辨能力的硬件进步。(b) 通过STEM的环形暗场像进行逐原子结构和化学分析。单个BN层密度泛函理论模拟的一部分，其中包含实验观察到的取代杂质，并叠加在实验图像的相应部分。红色为硼；黄色为碳；绿色为氮；蓝色为氧。 Rose (2009)

与光显微镜相比，电子显微镜需要保持较高的真空度，而且带电粒子与物质之间存在较强的相互作用，这对各类电子显微镜的实际应用造成了很大的限制。

2 扫描透射电子显微镜（STEM）的早期发展

Alexander Bain发明的传真机通常被认为是通过扫描系统形成图像的首次应用（Bain，1843年）。为了克服Abbe对光学显微镜分辨率的限制，Synge采用了扫描方法，通过使用孔径小于光波长的光探针来形成扫描图像（Synge，1928 ）。虽然在提高图像分辨率方面没有重大突破，但Synge提出了使用压电驱动器、在荧光屏上形成图像以及通过处理电子信号扩大图像对比度等建议。所有这些早期建议都被有效地用于开发最先进的扫描显微镜。

Stintzing提出的扫描显微镜专利能够利用光束或电子束自动检测和测量粒子（Stintzing，1929 年）。由于当时还不知道电子聚焦的可能性，Stintzing建议使用交叉狭缝来形成小直径的光或电子探针（McMullan, 1989）。当时还没有制造出实用的扫描显微镜来证明这些扫描成像系统的可行性。

在制造出第一台透射电子显微镜（TEM）后不久，Max Knoll开始研究电视摄像管，并开发出一种电子束扫描仪，用于观察这些摄像管。Knoll是第一个发表通过电子束扫描获得的图像的人 (Knoll, 1935)。Knoll 制造的电子束扫描仪的电子能量范围为500-4000eV，具有现代扫描电子显微镜（SEM）的主要特征。

Knoll证明，扫描电子显微镜的图像放大率可以通过改变扫描振幅的比率来控制：在显示屏尺寸固定的情况下，扫描区域越小，图像放大率越高。电视和电子显微镜先驱兹沃里金（Zworykin，1934 年；Zworykin 等人，1942 年）也对扫描图像的放大率有了这样的认识。通过电子束扫描仪，Knoll 不仅研究了阴极射线管，还研究了其他类型的固体样品，并确定了扫描图像的对比机制（Knoll, 1941; McMullan, 1995）。

Manfred von Ardenne是一位杰出的应用物理学家和多产的发明家，他制造了第一台 STEM，目的是在不降低图像分辨率的情况下对较厚的样品进行成像，因为色差效应是 TEM成像的一个主要问题（McMullan，1995 年）。

在短时间内发表的一系列文章中，von Ardenne详细分析了使用磁透镜的探针形成电子光学的设计和性能（von Ardenne, 1938a, 1938b, 1938c, 1939, 1940）。他讨论了透镜像差对探针尺寸的影响以及如何计算电子探针中的电流，说明了明场（BF）和暗场（DF）STEM 成像中探测器的位置，并考虑了电子束和放大器噪声对图像质量的影响。

在使用较小的电子探针进行高分辨率成像时，电子探针内的电子束总强度大大降低，导致需要较长的记录时间才能获得每幅可视图像。由于当时还没有合适的低噪声电子探测器，只能使用照相胶片来记录质量合理的 STEM 图像。获得每张小探针尺寸的 STEM 图像所需的采集时间很长，这给实际的 STEM 成像带来了致命的限制。

当使用大尺寸电子探针（探针电流较大，可快速获得光栅图像）时，只能获得低分辨率的 STEM 图像，与TEM相比没有任何优势。当时缺乏合适的电子探测器和高亮度的电子源，严重限制了高分辨率 STEM 的发展和应用。

另一方面，能高效率接收低能二次电子的Everhart-Thornley探测器（Everhart & Thornley，1960 年）的开发，使获得各类样品表面的高质量扫描电镜图像成为可能，剑桥仪器公司也因此成功地将第一台扫描电镜商业化。

(a) Manfred von Ardenne研制出第一台扫描透射电子显微镜（1938 年），当时电子束直径约为 10 纳米。他的第一幅图像是放大 8000 倍的氧化锌晶体。(b) 亚利桑那州立大学的 Nion 像差校正和单色 UltraSTEM 100：在 60/100 kV 下具有亚埃分辨率，在 30/40 kV下具有约 1 埃分辨率，在超快 EELS 中具有 10 meV 能量分辨率。

3 Albert Crewe和他的原子图像

Crewe于1963年提出了一种新型扫描显微镜，目的是克服使用电子束提高图像分辨率的障碍（Crewe，1963 年）。在1966年的论文中，Crewe分析了扫描显微镜的探针形成透镜后，意识到现有的扫描显微镜受到电子源问题的严重限制：电子源亮度太低，因此无法用任何可用电流将电子源放大到原子大小。

Crewe意识到利用更小的钨针尖进行场发射的实用性，并建议使用这种针尖作为电子枪来产生高亮度电子源。冷场发射枪的电流密度（10⁸-10⁹A/cm² sr）比热电子枪的电流密度（⁶ A/cm2 ）高出几个数量级，而且虚拟源的直径可以控制在10 纳米以下。

场发射电子枪（FEG）的使用有望大幅缩小电子探针的尺寸，从而提高SEM和 STEM的图像分辨率。Crewe进一步建议设计一种使用四极透镜的新型显微镜，并估计电子源的尺寸可以达到3纳米。

新显微镜需要保持超高真空以稳定电子发射，透射电子可由高速闪烁体光电倍增管系统检测。新提出的 STEM 可以方便地安装静电光谱计electrostatic spectrometer（Hillier和Baker，1944年），用于分析透射电子的能量，以增强图像对比度或提供化学成分成像。由于需要超高真空，预计污染问题不会对图像分辨率和/或图像对比度造成重大影响。

Crewe及其同事在1968年发表了简易 STEM 的设计方案，并制造了带有一个场发射电子源和一个透镜的STEM，可提供分辨率为3纳米的高对比度图像。场发射尖端需要低于10^-9托的真空压力才能稳定工作。即使只使用场发射电子源而不使用任何聚焦透镜，透射电子显微图像的分辨率也能达到约10nm，这一事实进一步证明了使用场发射钨针尖的威力（Crewe ，1969 年）。

与von Ardenne的STEM 相比，可实现的电子探针电流为 100-10 pA，扫描时间为10秒，这大大提高了电子显微图像的分辨率。FEG的使用不仅缩小了电子探针的尺寸，还极大地提高了探针电流密度，这两点使得高分辨率STEM图像的信噪比达到了合理的水平。

Crewe和他的研究小组设计制造的新型 STEM，性能突出在能够直接观测单个重原子（Crewe & Wall，1970年）。通过改进 STEM 的设计，Crewe和同事们建造了一个更坚固的圆柱对称磁透镜（焦距为0.6-1.0毫米），以降低球差系数（约0.4毫米）；安装了一个环形探测器（Cosslett，1965年），以增强不同元素的图像对比度并进一步提高信号强度；并附加了一个静电电子能谱仪（分辨率为 0.3 eV，主电子束为 25 keV），以收集特定能量的透射电子。

Crew在会上介绍了新型 STEM 的独特之处，并讨论了影响最终探针尺寸的各种参数（Crewe和 Wall，1970 年）。由于探针形成透镜和电子枪是刚性连接在一起的，光学系统的唯一校准就是确保场发射针尖位于显微镜系统的光轴上，并且在操作过程中针尖发射锥不会发生变化。

作者发现，与传统 TEM 相比，电子探针电流和收集到的信号强度与图像放大倍率无关。由于信号强度不会随图像放大倍率的变化而变化，因此 STEM 可以在高图像放大倍率（高达 5 × 10⁶）下运行。Crewe研究小组还认识到，“在试样上方使用大孔径，在试样下方使用极小孔径，可以获得相位衬度“。

Albert Crewe设计的STEM （a）、0.5 纳米分辨率的 STEM 仪器（b）、在他的 STEM上成像的钍原子链（c）、四极–八极校正器（d）和六极校正器（e）。https://www.microscopy.org/images/posters/Crewe.pdf。

即使在25千伏电压下使用0.5纳米的电子探针，Crewe及其同事也能观察到支撑在超薄碳薄膜上的单个重原子（Crewe，1970年）。他们利用环形探测器收集散射电子（不包括直接透过的电子），并利用电子能谱仪收集非弹性散射电子（穿过环形探测器的孔），从而获得了两种STEM 图像。这两幅图像的比例有望降低图像对比度对支撑碳膜厚度变化的依赖性，从而增强重原子的对比度。

通过详细分析，并将实验测得的可见度系数与理论计算得出的碳支撑铀原子和钍原子的可见度系数进行比较，作者得出结论，STEM 图像中的亮点代表了单个铀原子或钍原子的亮点。

为了进一步证实单个重原子可视化的结论，作者制备并检查了由孤立原子对组成的特殊样品。实验获得的图像与支撑在超薄碳薄膜上的相应分子的几何图案相吻合。这是首次实现用STEM直接对单个原子进行成像，因此，FEG STEM 在对单个重金属原子成像方面超越了传统 TEM 的能力（Crewe，1970 年）。

束班约0.5 nm的探针能对单个重金属原子成像，主要有四个主要因素：(1) FEG 的高电流密度；(2) 重金属原子之间的大距离；(3) 高的重金属原子对比度；(4) 超薄碳支撑，这大大降低了背景信号的强度。强烈的重原子对比源于信噪比，而信噪比在很大程度上取决于各个重原子的原子序数 “Z”（Crewe ，1971年）。

因此，通过处理不同类别的透射电子以形成新的图像，可以增强相关样品的元素分辨能力，尤其是对于支撑在非晶态轻元素薄膜上的重金属原子或原子团。借助分析非弹性散射电子的能力，Crewe及其同事（Crewe，1971）研究了快速电子与生物分子的相互作用，并测量了各种核酸碱基的相应能量损失光谱。他们进一步研究了利用能量损失电子信号增强生物样品图像对比度的潜力，研究了电子束诱发的辐射损伤现象，并提供了这些影响的测量方法。

随着 STEM 设计的进一步改进，在相对较高的电子束能量下运行，并使用环形暗场（ADF）探测器收集弹性散射电子，不仅可以对单个重原子成像，还可以分辨铀和钍化合物小晶体的原子柱（Wall ，1974b）。

此外，作者还利用单个汞原子的线强度曲线来估算精细聚焦电子探针的尺寸，并证明在 42.5 kV 电压下，半最大全宽（FWHM）为 0.25 ± 0.02 nm，总电子通量为 107 电子/Ų。

由于碳衬底上的单个重离子原子的信噪比会随着仪器分辨率的提高而增加，因此作者们建议使用更高的电子束电压（如100kV）和更小的探针尺寸（如 ），这样就能获得足够的信噪比，从而直接观察到元素周期表中一半以上的单个原子（Crewe，1974；Wall，1974）。此时，使用FEG 进行 STEM 成像已被明确证明是成功的，尤其是在对被重金属原子或原子团染色的生物系统进行成像时。

STEM探测器的灵活性以及对透射电子进行电子能量损失分析的能力，为在纳米尺度上定量评估生物结构的质量厚度和化学组成提供了一种新方法。ADF 成像方法被广泛用于确定大分子集合体的分子质量，并通过重金属标记将分离的蛋白质集合体可视化，从而将 STEM 广泛应用于生物学领域。

电子能量损失谱（EELS）在生物系统中的早期应用（Crewe，1971）促进了纳米尺度的EELS技术在细胞生物学、病理学、微生物学、组织学和生物医学科学其他分支中的应用。

本文源自微信公众号：老千和他的朋友们

原文标题：《STEM专题 | Albert Crewe的扫描透射电镜与原子图像》

原文链接：https://mp.weixin.qq.com/s/7Xql6uDKAYgs5CR9lnHZgA