透射电子显微镜（TEM）的工作原理是利用加速和聚焦的电子束投射到极薄的样品上，电子在样品中与原子发生碰撞后改变方向，从而产生立体角散射。这种散射的效果与样品的密度和厚度紧密相关，进而形成明暗不同的影像。透射电镜的分辨率极高，可达1～2nm，放大倍数更是高达几万至百万倍，这使得它能够观察到的结构远小于光学显微镜的极限，即所谓的“亚显微结构”。
然而，要成功进行TEM测试，样品必须经过特定的制备。针对不同类型的样品，有不同的制取方法。接下来，我们将介绍透射电镜中常用的制样技术。
样品载网有不同的形状和材料，最常用和最便宜的是铜网，它们的外径通常为3毫米，并有多种筛孔尺寸可供选择。
载网中间有一个大孔，需要覆盖一层电子透明薄膜。粉末最常用的薄膜是碳膜或孔状碳膜。这些薄膜对电子几乎是透明的，因此只需很少的样品制备工作就能轻松观察粉末样品。虽然这些薄膜可以在实验室制作，但大多数实验室都会购买预制的薄膜以满足自己的特殊要求。
除了保留样品原生状态下的形态和成分这一目标之外，样品制备的主要考虑因素是获得足够薄的切片，以便电子束能够穿过整个样品并从另一侧射出。
树脂聚合物用于支撑样品：比如柔软的生物、聚合物、粘土或微粒，通常在切片前嵌入树脂聚合物中。树脂聚合物必须坚硬，且有一定弹性，可以支撑样品并能从样品块中取出薄片（如70nm厚薄片）。如果样品是冷冻的，则无需在切片前进行树脂包埋。
天然硬质材料也可以通过其他方法制成薄片，例如切割小块，然后将中心区域凹陷、研磨、抛光或用离子束减薄。这样制作出的薄片无需进一步支撑。但这些工艺通常只用于热稳定或无机硬质材料，如金属和陶瓷。
1.结构敏感性：有机及生物样品通常较为脆弱,很容易在制样过程中受到损坏。需要特殊的固定、浸渍和脱水方法来保护样品结构。
2.水含量高：这类样品大多含有大量的水分子,需要经过脱水处理才能制备出真空下稳定的薄膜。
3.低衬度：生物大分子如蛋白质、核酸等原子序数低,在电镜下对比度较低,需要使用染色或其他增强手段。
4.制样困难：由于组织脆弱和含水量高,采用切片等机械手段制备薄膜很容易造成切片变形或断裂。需要更精细的微切方法。
5.电子束敏感：这类样品在电子束辐射下很容易发生结构破坏或化学反应,需要控制电子束强度和照射时间。
6.取样要求高：需要从复杂的生物样品中精确地切割出感兴趣的区域进行观察,操作难度大。
总之,有机和生物类样品由于其结构脆弱、含水量高等特点,TEM制样需要更加复杂精细的处理方法。样品制备是观察这类样品的关键步骤。
对于生物类样品，有三种主要的样品制备方法可以保存细胞结构并增强衬度。它们是：低温固定法、化学固定法和负染色法。
选择哪种技术处理样品取决于样品的性质、研究的目的以及设备类型。如果需要标记以精确定位蛋白质的样品（免疫标记），或需要切成薄片以观察固有形态的样品，就需要不同的方案。如果只想看到样品的轮廓或表面形状，则需要负染色技术。
1.高硬度和脆性: 无机材料如金属、陶瓷等通常更硬且更脆。
2.制样困难: 由于硬度高,很难采用切片等机械手段制备出均匀、无损的薄膜样品。需要采用离子轰击、机械研磨等更复杂的制备方法。
3.电子束辐射敏感: 一些无机材料在电子束照射下会发生结构变化或破坏。需要优化电子束强度和样品厚度等参数。
4.厚度控制困难: 由于硬度高,很难精确控制样品厚度达到TEM观察的最佳范围(通常20-100 nm)。需要多次尝试优化。
5.取样难度大: 有时需要从块状样品中切割出合适的薄片区域进行观察,这对取样位置的选择提出了很高要求。
总之,无机硬质样品的TEM制备需要更专业的技术和经验,操作过程更加复杂和困难。掌握适合的制备方法是重要的。
散装易碎材料需要先粉碎成小颗粒或粉末，然后再放到样品载网上，这可以通过使用小的玛瑙杵和研钵来实现，在材料上来回摇动研杵，使其破碎。碾碎成细粉后，粉末颗粒需要分散，然后再滴到载网或支撑膜上。为此，可将粉末加入乙醇等溶剂中，然后在密闭的小瓶/容器中进行短时间（如 30 秒至几分钟）的超声处理。然后用移液管将一滴悬浮材料滴到载网/支撑膜上，颗粒沉降到载网表面，在TEM中观察之前必须让溶剂完全挥发。
坚硬的金属样品可以用金刚石锯片切割成薄片。锯片切割时，会沿切割边缘喷洒液体作为润滑剂并减少热量。使用这种锯片将是 TEM 样品制备过程的开始，因为锯片无法切割出足够薄的样品以供观察。它们需要进一步变薄。
离子减薄技术是在高真空环境下进行的。通过Ar离子枪发射的聚焦离子束对样品表面进行连续冲击，从而实现样品的研磨减薄。离子枪的位置保持相对固定，而样品夹持台则具备同心旋转功能，以实现对样品上更大范围的减薄操作。
图中展示了离子减薄仪的结构，其中离子枪轰击的区域即为样品所在。离子减薄技术广泛应用于透射电子显微镜的薄膜样品制备，同时也可用于金属、非金属、半导体、陶瓷、岩石等固体材料的显微镜透射样品制备。
在应用离子减薄技术时，需要经过一系列的材料试样制备步骤。首先，将块状样切成约3毫米厚的均匀薄片，然后使用石蜡将其粘贴在超声波切割机的样品座上的载玻片上。接着，通过超声波切割机冲出直径为3毫米的圆片，再用金刚砂纸进行机械研磨，使其厚度降至约100微米。之后，利用磨坑仪在圆片中央部位磨出一个凹坑，凹坑的深度约为50至70微米，旨在缩短后续离子减薄的时间，提升减薄效率。最后，将处理好的洁净圆片放入离子减薄仪中，根据试样材料的特性选择合适的离子减薄参数进行减薄。通常，陶瓷样品的离子减薄过程需要2至3天，整个制备流程大约需要5天。
离子减薄技术的优点在于其污染小，特别适用于薄膜、双相合金以及陶瓷等材料。然而，它也存在一些缺点，如效率较低，且需要丰富的经验才能制备出高质量的样品。
此外，电解双喷制样技术也是另一种重要的制样方法。它适用于制备金属与部分合金样品，尤其适用于那些不易于腐蚀的裂纹端试样、非粉末冶金试样、组织中各相电解性能相近的材料以及不易脆断或清洗的试样。而离子减薄技术则更适用于制备不导电的陶瓷样品、质量要求高的金属样品以及不适宜双喷电解的金属与合金样品。
聚焦离子束，简称FIB，是一种利用电透镜将离子束高度聚焦的方法。这种技术能实现材料的精细剥离、沉积、注入、切割以及改性。随着纳米科技的飞速发展，聚焦离子束已成为纳米尺度制造业的核心技术。其代表性应用包括半导体集成电路的修改、离子注入、精确切割以及故障分析等。
离子源是聚焦离子束系统的关键组件，其性能直接决定了离子束的质量和稳定性。液态金属离子源作为目前应用最广泛的离子源，具有高亮度、极小源尺寸等显著优点。它通过强电场作用下的场致离子发射产生离子束，为聚焦离子束系统提供了稳定且高质量的离子源。
聚焦离子束系统是以液态金属离子源为基础，配合高精度电透镜和扫描电镜等设备，实现对材料的高精度纳米加工和实时观察。其应用范围广泛，涵盖了半导体集成电路的修改、离子注入、材料切割以及故障分析等多个领域。
聚焦式离子束技术，简称FIB是一种通过静电透镜将离子束高度聚焦的显微切割技术。在商用FIB系统中，离子束通常源自液态金属离子源，其中镓（Gallium，Ga）因其低熔点、低蒸汽压和出色的抗氧化性而被广泛用作金属材料。通过在离子柱顶端施加电场（Suppressor）于液态金属离子源，金属或合金会形成细小尖端。再利用负电场（Extractor）牵引该尖端，从而导出离子束。经过静电透镜的聚焦，以及一连串可变化孔径（Automatic Variable Aperture，AVA）的调节，可以决定离子束的大小。随后，通过质量分析器筛选出所需的离子种类。最终，借助八极偏转装置及物镜，将离子束精确聚焦在样品上并进行扫描。离子束轰击样品产生的二次电子和离子被收集并成像，或通过物理碰撞实现切割或研磨。
聚焦离子束技术（FIB）在多个领域中发挥着重要作用。在集成电路（IC）生产工艺中，一旦发现微区电路蚀刻存在错误，FIB技术能够精准切割并断开原有电路，再通过定区域喷金实现与其他电路的搭接，从而完成电路的修改，其最高精度可达5纳米。此外，若产品表面存在微纳米级的缺陷，如异物、腐蚀或氧化等，FIB技术同样能够精确地定位并切割缺陷位置，制备出适合电子显微镜观察的截面样品。另外，对于微米级尺寸的样品，经过表面处理形成的薄膜，其结构与基材的结合程度都可以通过FIB切割制样后，再利用电子显微镜进行观察。
这是供电子显微镜观察用的切片技术，要求切片极薄，通常厚度为40~50纳米，因此被称为超薄切片。在透射电镜的样品制备中，它是最基本且常用的方法。其制作过程与石蜡切片相似，包括取材、固定、脱水、浸透、包埋聚合、切片及染色等多个步骤。为了确保细胞结构在观察时能够保持其原始状态，取材过程中必须遵循“快、小、准、冷”的原则，即动作迅速、所取组织体积小、机械损伤小以及在低温环境下操作。同时，取材部位也必须准确无误。
固定的核心目的是保持细胞内各种细胞器和大分子结构的原始状态，同时确保它们稳固地位于原有位置。这可以通过物理和化学两种方法实现。物理手段如冰冻、干燥和微波，旨在稳定细胞结构；而化学方法则是利用特定的化学试剂来固化细胞。目前，化学固定法更为常用，有时也会结合物理-化学双固定技术。
四氧化锇，作为一种强氧化剂，它能与氮原子紧密结合，因此对细胞中的蛋白质成分具有出色的固定效果。
戊二醛，其优点在于对糖原、糖蛋白、微管、内质网和细胞基质等成分的有效固定。与四氧化锇相比，它对组织和细胞的穿透力更强，并且还能保留某些酶的活性，即使经过长时间的固定（几周甚至1-2个月），组织也不会变脆。然而，它无法保存脂肪成分，且不具有电子染色功能，对细胞膜的显示效果也相对较差。
双重固定法，通常结合使用戊二醛和锇酸。该方法包括预固定和后固定两个步骤，中间用磷酸缓冲液进行漂洗。预固定使用5%的戊二醛固定超过2小时，后固定则用1%的锇酸固定液进行1-2小时的固定，pH值维持在2-4之间。固定完成后，用缓冲液漂洗30分钟再进行脱水处理。
在包埋介质能够完全渗入组织内部之前，必须先彻底去除组织中的水分。这可以通过使用与水和包埋剂都能互溶的液体来实现，其中乙醇和丙酮是常用的脱水剂。为了避免细胞在急骤脱水过程中收缩，应采用梯度脱水方法：先用70%丙酮处理15分钟，再逐步提升至80%、90%和100%丙酮，每次处理均为15分钟。对于游离细胞，可以适当缩短脱水时间。过度脱水不仅会导致更多物质被抽提，还会使细胞变形、超微结构受损，同时增加样品脆性，从而造成切片困难或无法进行切片。
在完成上述步骤后，就可以进行浸透和包埋操作了。这些步骤对于制备高质量的超薄切片至关重要。
浸透是超薄切片技术中的关键步骤之一。它涉及使用包埋剂替代脱水剂，使组织内部充满包埋剂。这种包埋剂在聚合前为液体状态，能够深入组织内部。一旦加入催化剂并经过加热，它便会聚合成固体，为后续的超薄切片做好准备。目前，环氧树脂是常用的包埋剂。
在准备进行超薄切片之前，有两项重要的工作需要完成：修块和半薄切片定位。修块是通过手工对包埋块进行精细修整，使其露出组织部分，并修成锥体形，以便于后续的切片操作。而半薄切片定位则是利用超薄切片机切割出厚度为1μm至5μm的切片，并将其转移到载玻片上进行染色和观察，以确定观察范围和保留要用电镜观察的部分。
完成半薄切片定位后，需要对包埋块进行进一步修整，通常将其顶端修成金字塔形，顶面修成梯形或长方形，以便于后续的超薄切片操作。接下来，就可以使用超薄切片机进行超薄切片的制作了。在制作过程中，需要安装包埋块、玻璃刀，并调节刀与组织块的距离、水槽液面高度与灯光位置等参数，以确保切片的质量和精度。
染色是超薄切片制作的最后一步。常用的染色剂包括醋酸铀和柠檬酸铅，它们可以增强某些细胞结构的对比度，使观察更加清晰。染色方法一般分为组织块染色和切片染色两种方式。
综上所述，浸透、修块、半薄切片定位、超薄切片制作以及染色等步骤共同构成了超薄切片技术的完整流程。这些步骤的精细操作对于制备高质量的超薄切片至关重要。
本文源自微信公众号：简测科服
原文标题：《透射电镜TEM的多种制样方法：离子减薄、电解双喷、FIB与超薄切片》
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