用于透射电镜观察的生物样本该怎样预处理？

用于TEM观察的生物样本，主要为3种类型：组织、离心团和微粒悬液。

其中，动物的肝、肾、肠和植物叶片、根、茎等，就属于组织类样本。组织样本的特点是结构相对致密、稳定，取材操作较简单，但固定液的渗透和后续准确定位观察目标，有时存在一定难度。收集的贴壁培养细胞、精液、血液或细菌等，常通过离心，制备成团状样本送检。离心团与组织相比，收集操作相对繁琐，但固定效果良好且稳定。某些不耐受高速离心的藻类、细菌和培养细胞，密度太低的外泌体等，以及做负染色形态鉴定的纳米材料，则通过悬液方式送检。微粒悬液的取材操作十分简便，固定效果也很好（某些负染色材料不需要固定），但后期如需超薄制样，往往相对麻烦。

生物组织是TEM观察的主要样本类型之一，对后期制样技术的要求也最高。在预处理环节，减少操作损伤和提高固定效果，对后续制样质量具有决定意义。

首先看固定。组织由众多细胞及细胞外基质密集排列形成，具有一定的尺寸。因此，冷冻固定等方法，很难用到实体组织上。化学固定最适用，但电镜样本的主要化学固定剂成分——戊二醛，渗透速度却远远慢于甲醛。尺寸过大的样本，看起来是离体后马上投入固定液，其实1到2小时后，组织深部还根本没有固定液渗入呢！所以，组织类样本做TEM观察，要求最大厚度不超过3 mm（最好控制在2 mm内），且应在离体后1 min内浸入固定液。做到这两点，才能确保达到理想的固定效果。

所谓组织的“厚度”，是指组织样本最薄的方向上的尺度，并不是要求切成2 ~ 3 mm见方的颗粒。比如，小鼠的小肠，肠壁本身的厚度不到2 mm，切下一段肠管，就不必再切了。像脑海马结构这样的标本，取材时应切成宽而薄的冠状面薄片（片厚控制在3 mm以下）。这样，既保证了固定的质量，也便于制样人员准确判别切片方向。图1是动物组织切割常用的例子。

图1 动物组织常见的TEM块切割方式（从上到下依次为肾、脑、小肠）

植物组织的尺寸要求与动物组织相似。植物的叶片虽然看起来厚度很薄，似乎不用再切，但植物细胞具有细胞壁屏障，渗透比动物组织更慢。因此，把植物叶片沿叶脉方向切成细长条形是必要的，以便固定液从叶片的正反面和侧面同时渗入。茎、根等部位，更需要尽可能剖开，才能获得理想的固定效果（图2）。此外，植物组织富含空气，往往浮在固定液表面，影响液体渗入。用洁净脱脂棉把组织压在液面下，或用低真空泵抽气使组织下沉，都能解决问题。对大多数实验室，用脱脂棉的方法更加简便。

除了控制样本尺寸、尽可能缩短组织离体到开始固定的时间，保证固定液的量充足，对获得优良TEM图像也非常重要。一般来说，固定液体积和样本体积的比值不应小于20 : 1，最好达到50 : 1。为方便记忆和参考，图3的标准应当遵守。简言之，绿豆大小的样本，用1.5 ml离心管装；黄豆大小的样本，用5 ml离心管装；蚕豆大小的样本，要用20 ml平底容器装。上述规则针对的是每个容器只装1个样本的情况，类比的是样本体积。注意，只要组织厚度超过3 mm，不论是黄豆还是蚕豆大小，都必须切开，把厚度减小，否则中央部分肯定是没法用的。

再来看取材损伤。TEM的放大倍率和分辨能力均很高，稍有损伤，就会一览无余，干扰结构观察和分析。除了延迟固定造成的细胞成分自溶外，取材损伤最常见的形式是挤压伤、切割伤和渗透压不当造成的损伤。新鲜柔软的结缔组织，固定之前稍稍挤压，一般不影响结构的真实性。肝、肾、胰、神经等样本，尤其是神经，即使是固定前挤压，也容易产生机械损伤。大幅度拉扯、硬性切割（不要“剁”，应该是沿一个方向“划”、“割”）、钳夹等操作，势必带来结构破坏。刀片越锋利，刀片厚度越薄，切割损伤就越小。双面剃须刀片、薄的手术刀片、一次性石蜡切片刀片等，均为理想的选择。样本切薄后，尽可能直接投入足量固定液。除非含有大块淤血或较多粘稠分泌物、粪便等，TEM样本不要动辄用生理盐水或其它缓冲液冲洗。在不含添加剂的情况下，常用的PBS（磷酸缓冲生理盐水）和PB（不含氯化钠的磷酸盐缓冲液）的渗透压构成与细胞外基质大不相同，会增加固定假象。

脑和脊髓属于动物中枢神经系统，组织质地十分柔软，且神经元和胶质细胞普遍不耐受10 min以上的缺氧。既要杜绝手术取材和切薄时发生挤压、拉扯，又要迅速取出这些组织进行及时的固定，几乎办不到（组织投入固定液到渗透充分并开始固定反应，还有一段时间）。因此，用于TEM观察的脑和脊髓，首选灌注固定的方法。基本原理就是麻醉后，通过左心室（小动物）或颈总动脉（大动物）穿刺，以恰当压力注入电镜固定液，利用血液循环管道将固定液带到脑和脊髓中，实现及时、充分的固定（图4）。灌注压力的大小，与该动物的动脉血压相当即可。比如用输液瓶和头皮针给小鼠做经心脏灌注固定，瓶子挂在小鼠身体上方1.5 m高的地方就差不多。灌注后，就能不慌不忙地进行手术分离，不论是机械损伤还是固定假象，都可大幅减少。

体外培养的动物细胞，有贴壁、悬浮和三维培养3类。三维培养的细胞，可按组织样本的预处理方式，切薄后直接固定、送检。这里我们先看看贴壁细胞的预处理。悬浮细胞的操作和贴壁细胞相比大同小异。

把细胞从培养平面上分离下来，有刮取和消化两种方法。为了使细胞的膜性结构尽量保真，最好采用刮取的方式。如果要观察细胞连接，那就必须避免消化。

刮取的细胞收集在1.5 ml尖底离心管中，低速离心短时，让细胞富集，弃上清。加入电镜固定液重悬细胞，然后立即以10000 ~ 12000 rpm离心10 ~ 12 min。这里的离心转速和离心机转子尺寸有一定关系，小型离心机可能需要取较高的转速和时间。注意，加入固定液后必须尽快高速离心，久了可能难以离紧，后续运送和制样过程中可能分散丢失。

离紧成为稳固的细胞团后，尺寸须小于半颗绿豆大小（图5）。超过尺寸限制，底部的细胞没法充分渗透，在后续制样环节，会拖累整个细胞团的后固定、脱水、浸胶和聚合的质量。水平转子离心机处理的细胞团是半球形的，固定角转子离心机则制备出拖尾的细胞团。两种离心机都可使用。如果确保能控制好细胞量，不超过半颗绿豆大小，水平转子离心机得到的细胞团质量一般会更好一些。

如果是悬浮培养的细胞，直接收集在1.5 ml尖底离心管中，从低速离心弃上清开始操作，和贴壁细胞后面的步骤是一样的。

高速离心成团后，室温静置离心管30 min，吸去管内液体，沿管壁小心加入新的电镜固定液，即可送检或转入4 ~ 8℃暂存。

漂洗过的细菌、真菌，抗凝处理的血液细胞，经洗涤操作的精子，都可参考培养细胞，以离心团的形式送检做TEM制样和观察，只是某些场合使用的固定液种类有所区别。

有的细胞具有长的突起，或者本身结构因素所限，高速离心后形态可能大幅改变，就应当避免用离心团的形式送检。此外，纳米医药材料、病毒、外泌体样本等，需要通过负染色观察，也不适合离心成团。这类情况，用0.5 ~ 1 ml小管加满，直接送检微粒悬液更妥当。需要做超薄切片的样本，电镜技术人员会根据样本的性质，进行富集、粘结和其它处理。

样本在电镜固定液中能保存多久？

只要充分接触电镜固定液，生物样本的成分在接触后的2 h内，固定作用就已经充分。考虑到渗透时间和温度因素，过夜的固定，时间再怎么都足够了。再往后，固定作用基本停止，固定深度也不会改变。根据制样经验，只要保存在4 ~ 8℃，固定2天到2月的样本，结构上区别很小。一般的结构观察，基本不用担心。但是，固定液中存放超过2月，特别是液量不太足，且没有换液，样本的超微结构就可能“黑化”，表现为基质电子密度升高，结构边界的区分度下降，等等（图6）。因此，如果不得已要保存样本超过2月，应在第2月末，将样本转入等渗缓冲液中保存，直到开始制样。戊二醛对结构的交联固定作用与甲醛不同，是不可逆的，因此超微结构不会因为离开固定剂成分而崩坏。

固定液使用的时候是室温还是低温？

大多数生物样本的固定，应遵循室温开始固定、低温维持保存的原则。因此，即便保存的固定液是4℃的状态，固定前也建议复温到室温（20 ~ 25℃）使用。开始固定后，等待1 ~ 2 h（离心细胞仅需静置30 min），再转入4℃保存。某些特殊标本的固定，还需要和技术人员专门沟通，确定最佳的固定温度。

送检的样本是否需要用冰袋保持低温？

冰袋内装的一般是高比热的材料，能吸收大量的热，使周边物体的温度快速降低。这里有个背景知识：只要经过化学固定，样本绝对不能再结冰，哪怕只是冻结了一瞬间，结构就近乎全坏，没法满足观察要求（图7）。因此，冰袋有时候就是个危险品，不小心接触久了，导致样本结冻，前功尽弃。样本送检的时候，不少人的习惯是将容器装在有冰袋的泡沫盒中。这样做可保证较长时间维持低温。但必须注意：使用冰袋的情况下，既不能让盒内的温度降到冰点以下，也不能让样本容器接触到。从这一原则考虑，冬季较寒冷时，宁可常温运输。夏季炎热时，为防止运输途中意外暴晒，冰袋是必要的，但装盒前不要冻得太冷，且与样本容器之间务必用海绵、气泡袋等隔开，严防冻伤。

 

样本的切片和观察方向有明确要求，该怎么办？

有的组织，如植物叶片、茎干，动物肠壁、神经束、骨骼肌等，往往要明确地观察横断面或纵切面。为保证最终的观察平面满足方向要求，需要在3个环节做好定向操作。第1个环节是取材切割，这是送检前的步骤，由研究人员自行做好质控。比如植物样本按本文前述的方法切割；肠管保持环状，以便制样人员判断方向；骨骼肌应沿肌纤维走向切成长条，提示纵切的方位；如此等等。送检后，电镜室的技术人员会根据观察要求，按照样本的基本形态，对样本进行进一步修结，按规程修结成具有明确定向信息的组织块，这是保证方向的第2个环节。第3个环节是超薄切片之前，电镜技术人员会先制备半薄切片，在光镜下观察，确保选择方向正确的区域进行后续制片和观察。所以，研究人员在送检之前，只要按上述要求留下方向线索，别把样本切得太短小，完全不用担心最后观察时找不准方向。