穿越时光：生物样品 TEM 制备方法的发展溯源，从化学固定到免疫金标记的技术演进

总结：本文以时间线为脉络，系统介绍了生物样品透射电子显微镜（TEM）制备方法的发展历程，涵盖 9 大核心技术领域：化学固定、低温固定法、包埋介质、超薄切片技术、染色技术、金属阴影与复型技术、免疫标记、免疫酶标记及免疫金标记，同时简述了生物样品TEM制备的完整流程（固定-脱水-包埋-切片-染色）。

读者可学习到生物样品TEM制备各关键技术的起源、里程碑突破与技术细节，了解不同制备方法如何适配不同生物样品（细胞、组织、病毒等）的观察需求，为理解现代生物TEM样品制备技术的底层逻辑、开展生命科学微观研究提供全面的历史参考与方法学支撑。

电镜的发展史向我们揭示了一个重要的科技发展规律：仪器设备的进步必须与配套技术的完善相辅相成。20世纪40年代，尽管电镜的设计取得了显著进展，但在生命科学领域的应用却面临着重大挑战，其核心问题在于样品制备技术的局限性。

样品的保存质量是确保电镜观察效果的关键因素。为适应不同研究对象的特点，科研人员开发了两条独特的样品处理路径。对于分散细胞的研究，采用了在特制薄片上直接培养的方法，通过聚甲醛或醋酸纤维素涂层来固定细胞，随后将形成的薄膜经过处理并暴露于锇蒸气中。而对于组织活检样本，则需要经过更为复杂的固定、脱水、包埋和染色等一系列处理步骤。

这些样品制备技术的创新不仅解决了电镜在生物样本观察中的实际问题，更为后续生命科学研究奠定了重要基础。这一发展历程充分说明，在科学研究中，突破性进展往往需要多个技术领域的协同创新。

1 化学固定（Chemical Fixation）

电镜样品固定技术的发展历程反映了生物学研究方法的重要进步。

四氧化锇作为固定剂的卓越性质早已为人所知，1934年Ladislaus Marton和1939年Carl-Wolpers与Helmut-Ruska就已经使用它。1945年，Keith-Porter、A. Claude和E.F.Fullam将四氧化锇用于组织培养细胞的固定和染色。George Palade随后建议使用缓冲的四氧化锇，强调pH值和渗透压对细胞和组织超微结构保存的重要性。

1952年，Palade在电镜固定研究中取得开创性成果（使用缓冲的四氧化锇），为后续研究奠定了基础。这项技术的突破使科学家们能够更好地观察和研究细胞的超微结构。

1956年，J.H.Luft引入的高锰酸钾固定技术具有里程碑意义。这种方法特别适用于生物膜的高分辨率研究，极大地提升了细胞膜结构观察的清晰度。随后，Mollenhauer在1959年将这一技术扩展到植物细胞研究领域，进一步证实了高锰酸钾固定方法的实用价值。

到1963年，醛类固定剂的使用开启了新的篇章。Sabatini等人的研究表明，醛类固定不仅能够保持细胞的超微结构，还能保持酶活性。这一发现对于细胞生物学研究具有重大意义。1965年，Karnovsky开发的高渗透压甲醛–戊二醛固定剂更是将固定技术推向了新的高度。

这些技术进步标志着电镜样品制备方法的重要演进，为现代生物学研究提供了更加可靠和精确的观察手段。

2 低温固定法Low Temperature Fixation

低温技术作为电镜样品制备的重要方法，在20世纪中叶开始蓬勃发展。这一技术的引入和完善极大地推进了生物样品研究的进程，为揭示微观结构提供了革命性的工具。

1946年，Ralph Wyckoff首次将冷冻技术引入电镜样品制备领域，开创了物理固定方法的先河。这一突破性进展随后促使了临界点干燥等相关技术的发展。在此基础上，Humberto-Fernández-Morán于1951年率先将低温电镜应用于生物膜研究，为后续研究奠定了重要基础。

技术的持续改进在1952年迎来新的突破，Robley-Williams改进了冷冻干燥程序，进一步提升了样品制备的效果。而在1966年，David Branton对生物膜冷冻断裂机制的发现，揭示了膜在低温条件下沿疏水核心分裂的规律，这一发现对理解生物膜结构具有重大意义。

到1982年，J.Escaig开发的快速冷冻装置将该领域推向新的高度，实现了在超低温条件下（83K和6K）进行样品处理的技术突破。这些发展见证了低温技术在电镜领域从简单应用到精确控制的演变过程，为现代生物学研究提供了强有力的技术支持。

通过这些里程碑式的进展，低温技术已发展成为电镜样品制备中不可或缺的固定手段，为揭示生命科学的奥秘做出了重要贡献。

3 包埋介质Embedding Media

包埋介质在显微技术发展史上扮演着关键角色。自1949年以来，这一领域经历了多次重大突破，推动了生物样品观察和研究的进步。

最初，甲基丙烯酸酯的引入开创了现代包埋技术的先河。这种材料首次实现了适用于切片机的高质量切片制备。随后在1956年，研究人员开发出了更为稳定的新型树脂，解决了早期材料存在的聚合缺陷问题。其中，Vestopal等聚酯树脂的应用标志着包埋技术进入了新阶段。

20世纪50年代末至60年代初，环氧树脂的应用进一步推动了电镜观察技术的发展。尤其是Luft在1961年对环氧树脂包埋方法的改进，大大提高了样品制备的质量和可靠性。1960年的一个重要突破是水溶性包埋介质的引入，这种新型材料避免了传统乙醇脱水过程对样品造成的损害。

1982年，低温包埋技术的发展和新型树脂的研发，为免疫学研究开辟了新途径。这项创新使得更精确的超微结构观察成为可能，对现代生物学研究产生了深远影响。

总的来说，包埋介质的演进历程反映了显微技术的不断革新，为生物医学研究提供了越来越可靠的技术支持。

4 超薄切片技术 Ultramicrotomy

超薄切片技术的发展是电镜学发展史上的重要里程碑。这项技术让科学家们得以在纳米尺度上观察生物样本的内部结构，为细胞生物学研究带来革命性突破。

1943年，Fritiof Sjöstrand在瑞典开创性地研发了热进给超薄切片机，首次实现了骨骼肌的超薄切片观察。这一发明为后续研究奠定了重要基础。随后在1948年后，超薄切片技术进入快速发展期。Pease和Baker率先实现了传统切片机在电镜样品制备中的应用，而Bretschneider则提出了一种简化的切片方法。

技术创新在50年代达到高潮。Latta和Hartmann引入玻璃刀具，显著提升了切片质量。Porter和Blum的系统性研究则进一步完善了切片工艺。特别值得一提的是，Fernández-Morán在1956年首次将金刚石刀应用于超薄切片，大幅提高了切片精度。

1973年，Tokuyasu开发的超低温切片技术更是开创了超微结构细胞化学研究的新纪元。这些技术进步持续推动着生命科学研究的深入发展，使人们得以更加深入地理解生命的微观世界。

这些技术革新见证了显微技术从粗放到精细的演进过程，为现代生物学研究提供了重要的方法学支撑。

5 染色Staining（增强对比度）

电镜技术的一个关键挑战是如何提高样本观察的清晰度和对比度。20世纪50年代至60年代期间，科学家们在这一领域取得了重大突破，开发出多种创新性的染色和对比度增强技术。

1955年，Cecil-Hall的开创性研究首次发现了负染色现象，他观察到某些病毒颗粒在磷钨酸处理后呈现独特的负对比效果。这一发现随后得到Hugh Huxley在研究烟草花叶病毒时的证实。Brenner和Horne于1959年对负染色技术进行了系统性阐述，为后续病毒和大分子研究奠定了重要基础。

染色技术的进步在60年代达到新的高度。1963年，Reynolds开发的柠檬酸铅染色法显著提升了电镜观察的效果。到1969年，Bernhard提出的反向染色技术更是实现了DNA和RNA携带结构的精确区分，为细胞核结构研究开辟了新途径。

这些技术创新极大地推动了生物学研究的发展。从最初简单的重金属染色，到后来精确的分子水平染色技术，科学家们不断改进方法以获得更清晰的细胞超微结构图像，为现代生物学研究提供了重要工具。

这套完整的处理流程虽然繁琐，但每个步骤都是不可或缺的，它们共同确保了生物样品超微结构分析的准确性和可靠性。

6 金属阴影和复型技术 Metal Shadowing and Replicas

金属阴影和复型技术是电镜研究领域的重要技术突破。1942年，H.O.Müller首次引入金属阴影技术，为后续研究奠定了基础。这项技术在Williams和Wyckoff的研究中得到了创新性应用，他们将其与冷冻干燥技术相结合，成功用于病毒和大分子的观察研究，极大地推进了微观世界的探索。

到了1950年，Hall开发出在真空条件下制备冷冻材料复型的方法，这是复型技术发展史上的重要里程碑。这一技术突破为样品制备提供了更可靠的方法，提高了观察结果的准确性。

1957年，Steere对复型技术进行了关键性改进，创新性地在沉积复型层之前增加了断裂和蚀刻步骤。这一改进使得研究人员能够更深入地观察样品的内部结构，为生物样品的微观研究开辟了新的可能性。

7 免疫标记 免疫化学 Immunolabeling, Immunochemistry

免疫标记技术是现代生物医学研究中不可或缺的重要方法，其发展历程见证了免疫化学领域的重大进步。1959年，S.J.Singer开创性地将铁蛋白与免疫球蛋白进行偶联，创造了首个电子致密的免疫标记物。这一突破性发现为后续病毒学研究奠定了重要基础，特别是在电镜下识别特定抗原位点方面发挥了关键作用。

这项技术随后得到了C. Morgan等科学家的进一步发展和应用。到了1966年，免疫标记领域迎来了新的突破，科研人员开发出了多种新型抗体标记方法。其中，免疫酶技术主要应用于包埋前的样品处理，而免疫金标记则在包培后的组织切片和超低温切片中展现出独特优势。

这些技术的发展不仅推动了免疫化学研究的进步，也为现代生物医学研究提供了重要的实验手段。它们在抗原定位、蛋白质相互作用研究等方面的应用，极大地促进了我们对生命科学的理解。

8 免疫酶标记mmunoenzymatic labelin

免疫酶标记技术是现代免疫细胞化学研究中的重要方法，其发展历程堪称生物科学领域的一个重要里程碑。1966年，Graham和Karnovsky开创性地开发了辣根过氧化物酶（HRP）的细胞化学定位方法，为后续研究奠定了基础。

这项技术的核心在于将酶与抗体或抗原进行标记，从而实现在细胞和组织水平上的特异性检测。Avrameas、Uriel以及Nakane、Pierce等研究者的工作进一步完善了酶标记方法，极大地推动了免疫扩散技术的发展。特别值得注意的是，这种方法能够同时适用于光学显微镜和电镜观察，为研究者提供了更为全面的研究手段。

随着技术的不断进步，到了80年代初期，Geuze等人引入了胶体颗粒用于双标记免疫电镜研究，而Keller等人则改进了免疫电镜程序，开发出更为精确的超薄冷冻切片技术。这些进展显著提高了免疫标记的特异性和灵敏度。

时至今日，免疫酶标记技术已经成为生物医学研究中不可或缺的工具，在细胞生物学、病理学等领域发挥着重要作用。这项技术的发展史，充分展示了科学研究中精益求精、不断创新的重要性。

9 免疫金标记 Immunogold labelin

免疫金标记技术在现代生物学研究中具有重要地位。这项技术最早由Romano和Romano于1977年提出，他们首次将胶体金与金黄色葡萄球菌蛋白A结合，成功开发出了一种在电镜下观察抗原–抗体结合位点的有效方法。

这项技术的核心在于利用胶体金颗粒作为标记物。胶体金具有电子致密的特性，在电镜下呈现出清晰可见的黑点，便于观察和定位。同时，金颗粒可以与多种生物分子（如抗体、蛋白质）结合，具有良好的特异性和稳定性。

Bendayan等人在1980年的研究中，成功将该技术应用于胰腺蛋白的定量研究，证明了免疫金标记在亚细胞水平上的定位精确性。随后，deMey在1983年系统总结了免疫球蛋白–金结合物（IGS）的制备方法，并扩展了其在光学显微镜领域的应用，使该技术的使用范围得到进一步拓展。

免疫金标记技术的优势在于其高度的特异性、清晰的显示效果以及良好的重复性。这使其成为研究细胞超微结构、蛋白质定位等领域的重要工具。时至今日，该技术仍然是生物学研究中不可或缺的方法之一。

本文源自微信公众号：老千和他的朋友们

原文标题：《穿越时光：生物样品 TEM 制备方法的发展溯源》

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