激光共聚焦显微镜（二）功能及应用领域

激光共聚焦显微镜

单张光学切片功能：高清晰度、高分辨率图像采集，Pinhole、去除杂散光，实现“光学切面”。

多通道序列扫描：多色荧光标记成像，避免荧光串色。

连续光学切片，三维图像重构：通过 Z-stack 扫描，用软件重构细胞组织内 3D 真实空间结构。传统的显微镜只能形成二维图像，激光扫描共聚焦显微镜通过对同一样品不同层面的实时扫描成像，进行图像叠加可构成样品的三维结构图像。它的优点是可以对样品的立体结构分析，能十分灵活、直观地进行形态学观察，并揭示亚细胞结构的空间关系。

时间序列扫描：xyt 、xyzt 和 xt 扫描等，可以对 Ca²⁺、pH 及其它细胞内离子进行动态测量。激光扫描共聚焦显微镜技术是测量若干种离子浓度并显示其分布的有效工具，对焦点信息的有效辨别使在亚细胞水平显示离子分布成为可能。利用荧光探针，激光扫描共聚焦显微镜可以测量单个细胞内 pH 和多种离子（Ca²⁺、K⁺、Na⁺、Mg²⁺）在活细胞内的浓度及变化。激光扫描共聚焦显微镜可以提供更好的亚细胞结构中钙离子浓度动态变化的图像，这对于研究钙等离子细胞内动力学有意义。

大视野拼图：Tilescan 对大样品完整成像。

多点标记扫描：Mark and Find 设置后自动多次多点分别成像。

光谱扫描：自发荧光、串色荧光的准确分离。

光操作：光激活、光转换、光损伤、光漂白等实验。光漂白的原理是一个细胞内的荧光分子被激光漂白或淬灭，失去发光能力，而邻近未被漂白细胞中的荧光分子可通过缝隙连接扩散到已被漂白的细胞中，荧光可逐渐恢复。可通过观察已发生荧光漂白细胞其荧光恢复过程的变化量来分析细胞内蛋白质运输、受体在细胞膜上的流动和大分子组装等细胞生物学过程。

光损伤

样品经荧光探针标记；

固定的或活的贴壁培养细胞应培养在Confocal专用小培养皿或盖玻片上；

悬浮细胞，甩片或滴片后，用盖玻片封片；

载玻片厚度应在 0.8-1.2 mm 之间，盖玻片应光洁，厚度在 0.17 mm 左右；

标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不能充分激发；

尽量去除非特异性荧光信号。

激光扫描共聚焦显微镜是近代最先进的细胞生物医学分析仪器之一，已用于细胞形态定位、立体结构重组、动态变化过程等研究，并提供定量荧光测定、定量图像分析等实用研究手段，结合其他相关生物技术，在形态学、生理学、免疫学、遗传学等分子细胞生物学领域得到广泛应用。

激光扫描共聚焦显微镜应用照明针与检测孔共轭成像，有效抑制了焦外模糊成像并可对标本各层分别成像，对活细胞行无损伤的“光学切片”，这种功能也被形象的称为“显微 CT”。还可以对贴壁的单个细胞或细胞群的胞内、胞外荧光作定位、定性、定量及实时分析，并对胞内成分如线粒体、内质网、高尔基体、DNA、RNA、Ca²⁺、Mg²⁺、Na⁺ 等的分布、含量等进行测定及动态观察，使细胞结构和功能方面的研究达到分子水平。

对活细胞进行定量测定，具有很好的重复性，分析神经细胞和胶质细胞的某些物理及生物化学特性，监测抗原表达，细胞结合和杀伤等特征。在多发性硬化病人大脑活检标本上观察病变组织的微血管内皮细胞特异性的表达。

使用多种荧光探针，对神经细胞的 Ca²⁺、pH 及其它各种细胞内离子进行定量和动态分析。

激光扫描共聚焦显微镜使用模拟荧光处理，可将系列光学切片的数据合成三维图像，并可从任意角度观察。三维重建图像可使神经细胞及细胞器的形态学结构更加生动逼真。

小鼠脑神经干细胞切片共聚焦成像

动物和植物细胞中缝隙连接介导的胞间通信在细胞增殖和分化中起着重要作用。激光扫描共聚焦显微镜可通过观察细胞缝隙连接分子的转移来测量传递细胞调控信息的一些离子、小分子物质，对单标记或者多标记细胞、组织标本及活细胞进行重复性极佳的荧光定量分析，从而对肿瘤细胞的抗原表达、细胞结构特征，抗肿瘤药物的作用及机制等方面定量化。

该技术可以用于研究胚胎发生、生殖发育、神经生物学、肿瘤发生等过程中缝隙连接通讯的基本机制和作用，也可用于鉴别对缝隙连接作用有潜在毒性的化学物质。

Hela细胞F-Actin染色共聚焦成像

激光扫描共聚焦显微镜观察免疫细胞和系统，如树突状细胞、单核-吞噬细胞系统、自然杀伤细胞、淋巴细胞时，在准确细胞定位的同时有效鉴定免疫细胞的性质。

利用激光扫描共聚焦显微镜可以观察晶状体，角膜、视网膜、虹膜和睫状体的结构和病理变化。

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激光扫描共聚焦显微镜在观测骨细胞形态学研究、骨细胞特异性蛋白（骨钙素）以及骨细胞之间的相互作用具有显著的优势。

成人骨细胞

激光共聚焦显微镜通过对金属表面共聚焦扫描以及三维形貌的重建，自动完成表面磨损坑的提取，并实现尺寸分析和统计，得到磨损坑的体积和面积，也可以直接在三维图中提取待测位置的剖面线，计算磨损坑的横截面积和深度等信息。这对于金属表面大量腐蚀坑或磨损坑的评估以及耐磨材料的磨损性能评价，会起到事半功倍的效果。

金属腐蚀磨损分析

在对材料进行粗糙度分析时，无论是选择原子力显微镜还是台阶仪，分辨率、扫描范围以及扫描速度均无法同时兼顾。激光共聚焦显微镜可以在保证分辨率的同时完成高通量的扫描，并且由于是通过正置显微镜对表面进行非接触式扫描，样品即放即扫，操作简便。例如对合金钢样品表面不同区域进行粗糙度评价，去除样品本身形状的影响后，得到凹坑底部的粗糙度要小于表层。

通过激光共聚焦显微镜实现对MEMS不同位置的三维成像和尺寸分析，得到台阶的高度变化、最大深度和平均深度。

MEMS三维分析