激光扫描共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM）是 20 世纪 80 年代中期发展起来并得到广泛应用的新技术，它是激光、电子摄像和计算机图像处理等现代高科技手段渗透，并与传统的光学显微镜结合产生的先进的细胞分子生物学分析仪器，在生物及医学等领域的应用越来越广泛，已经成为生物医学实验研究的必备工具。
传统荧光显微镜使用荧光物质标志细胞中的特定结构，不仅图像与背景的对比度增强，而且由于许多荧光显微镜的光源使用短波长的紫外光，大大提高了分辨率（δ=0.61·λ/NA，其中 δ 为显微镜的分辨率；λ 为照明光线的波长；NA 为物镜的数值孔径）。
但当所观察的荧光标本稍厚时，传统荧光显微镜一个难以克服的缺点就显现出来：焦平面以外的荧光结构模糊、发虚。原因是大多数生物学标本是层次区别的重叠结构（如耳蜗基底膜。其实是外毛细胞 、多种支持细胞 、神经纤维等组成的空间结构），在普通光学显微镜下聚焦平面的变化，会表现出不同的形态。
假若荧光标记的结构在不同层次上都有分布，且重叠在一起，反射荧光显微镜（epifluorescent microscope）不仅从焦平面上收集光量，而且来自焦平面上方或下方的散射荧光也被物镜所接收，荧光显微镜的光学分辨率就要大大降低 。
在传统光学显微镜基础上，激光扫描共聚焦显微镜用激光作为光源，采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图像处理观察、分析和输出。其特点是可以对样品进行断层扫描和成像，进行无损伤观察和分析细胞的三维空间结构。
同时，利用免疫荧光标记和离子荧光标记探针，该技术不仅可观察固定的细胞、组织切片，还可以对活细胞的结构、分子、离子及生命活动进行实时动态观察和检测，在亚细胞水平上观察诸如 Ca2+，pH 值，膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学、遗传学等领域中新一代强有力的研究工具，极大地丰富了人们对细胞生命现象的认识。
非共聚焦显微镜图像和共聚焦显微图像对比（从左至右）
激光共聚焦扫描显微镜用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。
在结构配置上，激光扫描共聚焦显微镜除了包括普通光学显微镜的基本构造外，还包括激光光源、扫描装置、检测器、计算机系统（包括数据采集、处理、转换、应用软件）、图像输出设备、光学装置和共聚焦系统等部分。
激光共聚焦显微镜基本结构示意图
显微镜是 LSCM 的主要组件，它关系到系统的成像质量。通常有倒置和正置两种形式，前者在活细胞检测等生物医学应用中使用更广泛。显微镜光路以无限远光学系统为佳，可方便地在其中插入光学选件而不影响成像质量和测量精度。
物镜应选取大数值孔径平场复消色差物镜为好有利于荧光的采集和成象的清晰。物镜组的转换，滤色片组的选取，载物台的移动调节，焦平面的记忆锁定都应由计算机自动控制。
LSCM 使用的扫描装置有两类，台扫描系统和镜扫描系统。台扫描通过步进马达驱动载物台，位移精度可达 0.1μm，能够有效地消除成像点横向像差，使样品信号强度不受探测位置的影响，可准确定位定量地扫描检测视野中每一物点的光强度，缺点是载物台机械移动、图像采集速度较慢。
镜扫描有双镜扫描和单镜扫描两种，通过转镜完成对样品的扫描。由于转镜只需偏转很小角度就能涉及很大的扫描范围，图像采集速度大大提高，有利于那些寿命短的离子作荧光测定，但因光路略有偏转会对通光效率和像差有所影响扫描系统的工作程序由计算机自动控制。
LSCM 使用的激光光源有单激光和多激光系统。氪氩离子激光器是可见光范围内使用的多光谱激光，发射波长 488nm、568nm 和 647nm 分别为蓝光、绿光和红光；大功率氩离子激光器是紫外和可见光混合激光器，发射波长 351-364nm、488nm 和 514nm 分别为紫外光、蓝光和绿光。单个激光优点是安装方便、光路简单，但价格较贵并存在不同激光之间的光谱竞争和色差校正问题。
多激光器系统在可见光范围使用氩离子激光器，发射波长为 488nm 和 514nm 的蓝绿光，氦氖激光器发射波长为 633nm 的红光，紫外光选用氩离子激光器，波长为 351-364nm。其优点是各谱线激光单独发射不存在谱线竞争的干扰，调节方便，但光路复杂，光学系统共轴准直调试要求高。
1996 年新型双光子激光器问世，利用双光子倍频效应，使用可见光激光来代替紫外激光作激发光源达到检测紫外探针的目的。双光子激光能使活体细胞荧光损伤减少成象质量改善，增强对样品深层的观察能力。
LSCM 为多通道荧光采集系统，光路上要求至少有三个荧光通道和一个透射光通道，如有第四荧光通道更好，可对物体进行多谱线激光激发，样品发射荧光的探测器为感光灵敏度高的光电倍增管（PMT），配有高速 12 位 A/D 转换器，可以做光子计数。每个 PMT 前设置单独的针孔，由计算机软件调节针孔大小，光路中设有能自动切换的滤色片组，满足不同测量的需要。
入射到 PMT 的光经过以下过程后才能输出信号：荧光到达光阴极面，发生光电转换，放出光电子（外光电效应）→ 光电子经聚焦极汇集到第一倍增极，然后再相继经过各倍增极（发射二次电子），进行二次电子倍增 → 最后由末极倍增极发射的二次电子通过阳极输出。
激光共聚焦显微镜脱离了传统光学显微镜的场光源和局部平面成像模式，采用激光束作光源，激光束经照明针孔，经由分光镜反射至物镜，并聚焦于样品上，对标本焦平面上每一点进行扫描。
组织样品中如果有可被激发的荧光物质，受到激发后发出的荧光经原来入射光路直接反向回到分光镜，通过探测针孔时先聚焦，聚焦后的光被光电倍增管（PMT）探测收集，并将信号输送到计算机，处理后在计算机显示器上显示图像 。
在这个光路中，只有在焦平面的光才能穿过探测针孔，焦平面以外区域射来的光线在探测小孔平面是离焦的，不能通过小孔。因此，非观察点的背景呈黑色，反差增加，成像清晰。
由于照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔与探测针孔，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，即共聚焦。以激光作光源并对样品进行扫描，在此过程中两次聚焦，故称为激光扫描共聚焦显微镜。
看到这，大家应该对激光共聚焦显微镜的原理和构造有了初步的了解，那它的在应用过程中的主要功能和优势有哪些呢？又有哪些领域可以用得到激光共聚焦显微镜呢？请看下期！
本文源自微信公众号：中科蓝海ZKBO
原文标题：《激光共聚焦显微镜（一）结构及成像原理》
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