单颗粒冷冻电镜技术：解析技术突破、应用价值与未来方向，赋能生物大分子结构研究

总结：本文详细介绍了单颗粒冷冻电镜技术的发展背景、历史演进、核心技术突破（直接电子检测相机提升信号质量、新图像处理算法优化数据解析、显微镜自动化降低使用门槛），以及在结构生物学领域的应用（如解析 TRP 离子通道、剪接体复合物等难结晶生物大分子结构），同时展望了该技术未来的发展方向。

读者可系统学习到单颗粒冷冻电镜技术的原理、关键发展节点与技术优势，了解该技术如何突破传统方法局限，为开展生物大分子结构研究、推动结构生物学及药物研发领域的创新提供实用的技术参考与思路。

“冷冻电镜（Cryo-EM）主要指三种非常不同但又密切相关的技术：电子晶体学、单颗粒冷冻电镜和电子冷冻断层扫描。在过去的几年中，单颗粒冷冻电镜引发了结构生物学的一场革命，并成为一门新的主导学科。本综述回顾了该技术在过去40多年中的起步和发展历程，深入探讨了最近的技术进步如何以及为何具有如此大的突破性，并简要探讨了该技术未来的发展方向。”

1.结构生物学家面临的难题

物理学家、诺贝尔奖获得者理查德–费曼（Richard-Feynman）曾说过一句名言：“要回答许多基本的生物学问题其实非常容易，只需观察一下就可以了！“。事实上，结构生物学背后的核心理念是：一旦我们能够足够详细地 “观察“”事物“以辨别它们的原子结构，我们自然就能回答复杂生物过程的各个组成部分和参与者是如何以及为什么以这种方式工作的。

为了实现这一目标，结构生物学为历史上的重大生物学发现做出了巨大贡献。它也已经并将继续促进治疗药物的开发，以治疗疾病或改善病理症状。

结构生物学家可利用的主要技术有X射线晶体学、核磁共振（NMR）光谱学和电子显微镜（EM）。其中，X射线晶体学为蛋白质数据库(PDB)中保存的大部分生物大分子的原子坐标做出了贡献。X射线晶体学主要是通过生物大分子有序的三维（3D）晶体产生的衍射图样来确定结构，所测定结构的分辨率很大程度上取决于晶体的质量；简而言之，利用该技术测定任何生物大分子的原子结构的前提条件通常是获得足够大的有序三维晶体。

对于许多蛋白质或稳定的复合物来说，这种方法效果很好；然而，对于某些类别的生物大分子来说，生长大而有序的三维晶体是一项非常困难或不可能完成的任务。例如，结晶完整膜蛋白或大型动态复合物可能具有挑战性。X射线晶体学的延伸是X射线自由电子激光（XFEL），其最终目标是在没有晶体的情况下确定原子结构，但目前仍需要大量的小晶体。

生物大分子的原子结构能否在没有结晶的情况下确定？或者是否有可能像费曼曾经建议的那样，通过使用电子显微镜 “观察“它们来确定它们的结构？

20世纪70年代，早期的先驱们一直在追寻这个问题，并开发出了一种新的基于电磁学的方法，即今天的单颗粒冷冻电镜法（cryo-EM）。起初，这种方法得到的结果分辨率很低。然而，由于有望在不结晶的情况下研究生物大分子，冷冻电镜界在40多年的时间里致力于完善该技术，使该技术的适用性和结果的分辨率不断提高。冷冻电镜逐渐成为结构生物学的重要工具，是X射线晶体学的补充，被广泛用于研究难以结晶的大分子复合物。

几年前，一些惊人的技术突破使这种方法进一步实现了常规原子分辨率结构测定。今天，单颗粒冷冻电镜已不再是一种补充技术，而是一种主导技术，它以前所未有的方式深刻地改变着结构生物学领域，促进了重大的新发现。

2 单颗粒冷冻电镜简史

在电子显微镜下 “观察“生物大分子实际上是非常困难的。从电子显微镜图像中确定其原子结构甚至更为复杂。

首先，电子显微镜图像是生物大分子的二维投影，而不是其三维结构。De Rosier和Klug解决了这个问题，他们证明了三维结构可以通过组合同一物体沿不同方向的二维投影图像来重建。其次，由于散射很强，电子束必须被限制在高真空环境中，所有的样品都必须放置在真空环境中。这对于无机材料来说不是问题。但是，如果只是将生物样品放置在电子显微镜中，真空引起的脱水就会破坏样品的结构完整性。

Taylor和Glaeser完成了这一看似不可能完成的任务，即在高真空中保持蛋白质样品的含水状态。他们从冷冻的含水过氧化氢酶晶体中记录到了分辨率高于3埃的电子衍射图，证明了生物大分子在高真空中的结构完整性可以通过冷冻水合来保持（图1A）。然而，这种方法的实际应用并不容易，直到Dubochet及其同事在20世纪80年代开发出一种骤降式冷冻技术。

骤降式冷冻技术：他们将溶液中纯化的蛋白质样品置于覆盖有一层薄碳孔膜的TEM网格上，然后用滤纸将网格吸干，滤纸吸去了大部分溶液，表面张力使剩余的溶液穿过碳膜上的小孔形成一层薄薄的液膜。将网格迅速放入由液氮冷却的液态乙烷中，使其冻结成一薄层无定形冰，蛋白质样品以随机方向嵌入其中。然后，将冻结的网格转移到电子显微镜中，并保持在接近液氮的温度下进行成像（图1B）。这种方法仍在常规使用，没有大的改变，只是我们现在使用一台机器来对网格进行吸附和插入，其参数可调。

图1 单颗粒冷冻电镜案例。(A)冷冻水合过氧化氢酶晶体的电子衍射图。衍射斑点在超过3埃的分辨率下清晰可见，该实验确立了冷冻电子显微镜的概念。(B)冷冻水合腺病毒颗粒的电子显微照片。 (C)通过电子晶体学首次确定的细菌视紫红质（bacteriorhodopsin）的三维重建。(D)通过对大肠杆菌中负染色的大核糖体亚基的单颗粒重建，确定了50S核糖体亚基的三维模型。

第三，高能电子束的辐射损伤限制了用于生物样品成像的电子总剂量。在低电子剂量下记录的图像信噪比（SNR）非常低，将样品冷却到液氮甚至液氦温度可以减少辐射损伤，使样品能够承受更高的电子剂量，但仍然远远不能直接观察到原始显微照片的高分辨率细节。

Henderson和Unwin利用晶体学方法克服了这一问题，他们将许多相同的蛋白质堆积成二维晶体的图像平均化。用极低电子剂量记录的葡萄糖包埋二维晶体图像显示不出任何可见特征，但其傅立叶变换却显示出清晰的反射。同样，在极低电子剂量下对这种二维晶体进行的电子衍射也产生了高质量的衍射图样。

将从图像的傅立叶变换中计算出的相位和从衍射中获得的振幅结合起来，可以得到试样的高分辨率投影图。将从不同角度倾斜的试样上收集到的数据进行组合，可生成类似于X射线晶体结构密度图的三维重建图。这种方法产生了第一个整体膜蛋白结构，最初分辨率为7埃（图1C），最后达到原子分辨率。

这种方法后来被称为电子晶体学，它依赖于有序的二维晶体。这种方法已经确定了几种完整膜蛋白和一种可溶性蛋白的原子结构，达到的最高分辨率为1.9埃，解析了围绕aquaporin-0 (AQP0) 水通道的脂质双分子层。但生长有序二维晶体的困难阻碍了该方法的广泛应用。

3 “单颗粒冷冻电镜结构的分辨率取决于许多因素……”

与此同时，Frank提出了一种在不结晶的情况下确定蛋白质结构的想法：通过计算将许多相同类型的单个蛋白质颗粒的图像结合起来。这一新颖的想法首先通过观察负染色的蛋白质样品进行了测试（图1D）。这种方法后来与冷冻样品制备相结合，成为我们现在所说的“单颗粒冷冻电镜“技术。

该技术不需要将蛋白质培养成任何形式的晶体。相反，它通过计算排列和组合玻璃体冰薄层中随机定向的许多生物分子的冷冻电镜图像来确定结构。为了提高信噪比并提供三维重建所需的所有不同视图，需要大量图像。

此外，电子显微图像记录的是由衬度传递函数（CTF）卷积的试样投影。CTF是一个正弦函数，以频率相关的方式摆动，在频率空间中调节图像的相位和振幅。除了一些与显微镜相关的参数外，CTF还取决于记录的图像偏离焦点的程度，即所谓的 “离焦“。为了保持最高分辨率，必须在非常接近焦点的位置记录图像。

这种图像的衬度非常有限，这对于对电子辐射不敏感的无机材料来说不是问题，因为这些材料可以使用非常高的电子剂量进行成像，从而在保留高分辨率信号的同时产生足够的衬度。但对电子辐射敏感的冷冻水合生物样品的图像而言，必须用大散焦记录才能产生足够的衬度，这反过来又会削弱高分辨率信号。

单颗粒冷冻电镜结构的分辨率取决于许多因素，包括单个颗粒图像的分辨率和衬度、这些图像相互对准的准确性、在合理的时间范围内从大分子的所有必要视图中获得足够数量的图像、这些颗粒的构象和组成的均匀性，以及是否有足够强大的计算机来高效处理图像。

这些因素中的任何一个条件不理想—例如，电子显微镜系统不稳定、图像记录装置和电子束引起的样品漂移、图像质量和计算算法限制了颗粒图像分类和配准的准确性、处理大量颗粒图像的计算机能力有限——都会限制分辨率。由于这些技术上的挑战，在很长一段时间内，所达到的分辨率远不足以推导出全新的原子模型。

尽管如此，单颗粒冷冻电镜理论上可以达到原子分辨率的预测还是让显微镜学家们倍受鼓舞。这一预测是通过考虑生物样品能够承受多大的电子散射，这种散射能够产生多少结构信息或信噪比，以及在完美的情况下，需要多少幅图像才能产生给定分辨率的重建图像而得出的。

尽管这种说法是大胆的，但其背后的理论是坚实的，这促使冷冻电子显微镜界将这一方法推向完美。终于，在Henderson提出这一预言20年后，直接电子检测相机的开发和商业化取得了必要的突破。新型照相机的功能不断扩大，计算能力空前提高，推动了新型计算算法的发展，从而使冷冻电子显微镜图像的质量能够可靠地满足原子结构测定的需要。单颗粒冷冻电镜的原子分辨率潜力终于成为现实。

4 变革性的技术突破

4.1 直接电子检测相机

自冷冻电子显微镜问世以来，电子显微图像都是记录在照相胶片上，然后在暗室中进行处理并数字化，以便进行计算处理。对于单颗粒冷冻电子显微镜来说，胶片的性能足以产生亚纳米分辨率的三维重建。由于感光胶片在保留低频信号方面特别差，因此很难进一步提高分辨率。因此，为了产生足够的衬度以进行粒子拾取或配准，我们使用高离焦率记录图像，但代价是失去高分辨率信号。

对于大的二十面体病毒，可以对同一试样区域记录两幅图像，第一幅用低焦距记录以保留高分辨率信号，第二幅用高焦距记录以产生足够的衬度。经过努力，一些病毒颗粒的分辨率已接近原子水平，但整个过程缓慢而繁琐，限制了结构测定的通量。

20世纪90年代末，电荷耦合器件（CCD）照相机开始以数字方式记录电磁显微照片。CCD相机不能直接探测电子，需要荧光闪烁体将电子转换为光子信号。这种转换将单个电子撞击传感器的点事件模糊为尺寸大得多的光子团，从而降低了高分辨率信号。CCD照相机的特点是探测量子效率（DQE），它测量照相机在空间频率上保留的信号水平，因此不适合常规的高分辨率结构测定（图2A）。尽管如此，将CCD照相机引入冷冻电镜仍具有重要意义，因为它有助于自动图像采集。

图 2 借助直接电子探测照相机进行原子结构测定 (A)基于闪烁体的CCD照相机（黑色）和直接电子探测照相机K2在基本模式（蓝色）和超分辨率计数模式（红色）下的DQE曲线比较。(B)使用直接电子探测照相机记录的古细菌20S蛋白酶体(分子量约700 kDa)的典型电子显微图像。(C)根据(B)中的图像计算的傅立叶功率谱。(B)和(C) 可以清楚地看到约3 Å分辨率的高分辨率信号(60)。(D)古细菌20S蛋白酶体三维重建密度图的一部分。

将单颗粒冷冻电镜从“blobology”提升为原子结构测定实用技术的一个重大突破是引入了直接电子探测相机。这种照相机直接检测电子撞击照相机传感器所产生的电荷，从而更精确地定位电子，其DQE大大高于基于闪烁体的照相机。这些传感器的帧频也很高，因此可以在很短的时间内将冷冻电子显微镜图像记录为一叠电影帧。

某些照相机甚至可以在每一帧上对单个电子事件进行计数。这种单个电子计数相机的DQE甚至更高（图2A）。直接电子探测照相机记录的图像在高频和低频下都能保留信号，高频用于高分辨率结构测定，低频用于图像配准所需的衬度（图2，B和C）。

能够以电影堆栈形式记录图像促进了许多新的成像方法，这些方法对于最大限度地提高可实现的分辨率至关重要。最重要的是，它可以纠正电子束引起的图像运动并部分减轻辐射损伤，解决了冷冻电子显微镜中最棘手的两个问题。直接检测相机的使用、运动校正的改进以及在高电子剂量下记录图像的能力使得许多蛋白质的原子分辨率三维密度图的重建成为可能。

4.2 新的图像处理算法

重建的分辨率还取决于样品的构象均匀性和用于重建密度图的所有颗粒的图像配准精度。因此，图像分类和配准是计算图像处理中最关键的两个步骤。由于每个颗粒图像的信噪比较低，因此无法确定地将单个颗粒分类并分配到特定的类别和方向，这使得概率方法更适合图像分类和配准。

20世纪90年代末，人们开始尝试在冷冻电子显微镜图像处理中使用基于最大似然法的概率方法。后来，一种贝叶斯方法被描述并在RELION中实现，RELION是一种用户友好的程序，很快在单粒子冷冻电子显微镜图像处理中非常流行。这种方法比传统的确定性方法更强大、更稳健，特别是从更大、更异质的数据集中对具有同质构象的粒子图像子集进行分类。巧合的是，这一发展与直接电子探测相机在冷冻电子显微镜中的广泛应用同时发生。这两者的结合使得20多年前理论上预测的单粒子冷冻电镜的全部潜力得以实现。

4.3 电子显微镜的自动化

从技术上讲，单颗粒冷冻电镜是一项相当复杂和繁琐的技术。每次重建都需要大量高质量的冷冻电镜图像。这些图像主要由在操作复杂的电子显微镜方面具有多年培训和经验的人员收集。对用户的技术要求很高，因为他们不仅需要对电子光学系统有很好的了解，还需要了解与冷冻电镜数据采集相关的许多基本技术问题。他们还需要非常有耐心，在显微镜前长时间重复相同的操作步骤，以便采集大量的显微照片。所需的专业知识水平使得单颗粒冷冻电镜无法进入更广泛的结构生物学领域。

幸运的是，Carragher和Potter很早就意识到了这一问题，并率先开发出了高质量数据采集的自动化技术。电子显微镜本身也在不断发展，以更好地适应自动化数据采集。现在，许多冷冻电镜设备的运行方式类似于X射线同步加速器光束线—由少数训练有素的科学家支持。在这些设施中，只需经过少量培训的普通用户也可以通过使用自动化程序获取高质量的冷冻电镜数据，甚至是远程数据。

5 结构生物学的新时代

得益于单颗粒冷冻电镜技术的突破，结构生物学进入了一个新时代。许多难以结晶的样品结构现在触手可及。其中一个领域是整体膜蛋白。一个具体的例子是瞬态受体电位（TRP）离子通道。TRP通道超家族包含7个亚家族，人类共有27个成员。这些通道发挥着不同的生理作用；其中一些是治疗各种人类疾病的药物靶点。除了一些小的结构域，试图结晶TRP通道超家族任何成员的努力都失败了。

当通过单颗粒冷冻电镜测定了TRPV1离子通道—一种在感热和激活疼痛通路中发挥生理作用的辣椒素受体—在三种不同功能状态下的原子结构时，这种结构信息缺乏的状况结束了。这一发现证明了单粒子冷冻电镜的强大功能，并表明它在确定难以结晶的高难度蛋白质复合物的原子结构方面可与X射线晶体学相媲美。

TRPV1结构促使许多晶体学家认真考虑冷冻电子显微镜，许多人迅速抓住机会将其应用于他们最喜欢的困难目标。随着结晶这只拦路虎被清除，完整膜蛋白的原子结构现在正被快速测定。在不到5年的时间里，7个TRP通道亚家族中每个家族至少有一个成员的原子结构已经被确定（图3）。

图3 单粒子冷冻电子显微镜实现了TRP通道的原子结构测定。TRP通道超家族每个亚家族的原子结构带状图。它们是TRPV1(49)、TRPA1(61)、TRPM4(62)、TRPC4(63)、NOMPC（也称TRPN1）(64)、PKD2（或TRPP2）(65)和TRPML(66)。单颗粒冷冻电镜使整体膜蛋白结构测定的速度之快前所未有。

单颗粒冷冻电镜还改变了许多结晶无法实现的大型动态复合物和机器的结构研究。传统的方法是将单个组分或结构域的晶体结构拟合到整个复合物的低分辨率冷冻电镜密度图中。现在，许多大型复合体的原子结构可直接通过单粒子冷冻电镜确定。剪接体复合物就是一个很好的例子。过去的努力产生了一些小组分的原子结构以及整个复合体的低分辨率冷冻电镜结构。

现在，在短短几年内，不同功能状态下剪接体的原子结构已被确定。我们还可以举出更多的例子来说明近年来单颗粒冷冻电子显微镜技术的突破如何改变了我们解决复杂生物学问题的方式。结构生物学的快速发展是前所未有的。它还吸引了大型制药公司，许多公司希望将冷冻电镜应用到基于结构的药物发现和优化中。

6 未来

随着许多新技术的开发，单颗粒冷冻电子显微镜继续快速发展。其中一个例子是Volta相板，它是放置在显微镜物镜后焦平面上的一层碳薄膜。它为CTF增加了相移，使近焦点记录的图像具有良好的衬度，有助于研究非常小的蛋白质。

另一个例子是一种新样品制备技术的开发，它与目前的印迹方法有本质区别。这种新方法有许多优点，包括将所需样品总量从微升减少到纳升。

尽管这些创新令人印象深刻，但仍有许多技术细节有待改进。定期实现接近2埃甚至更高的分辨率是一个目标，而提高稳健性和通量则是另一个目标。一旦能够可靠地实现极高分辨率，制药公司将能够常规使用Cryo-TEM加速基于结构的药物发现。单颗粒冷冻电镜的研究范围还可以扩大，包括分辨率更高的更小或更大的目标，以及形状不规则的更动态的复合物或集合体。

如果我们继续推动这项技术的发展，单颗粒冷冻电镜在结构确定之外还能为进一步的生物学发现提供更多的帮助。例如，从理论上讲，图像分类可以将包含不同构象或组成的颗粒的冷冻电镜数据集分为多个类别，每个类别对应不同的功能状态。通过在特定时间点冷冻冷冻电子显微镜网格，有可能以时间依赖的方式获得结构信息。因此，有可能以完整的原子细节逐步理解和分解生物大分子复合物和机器的复杂循环、运动和过程。未来，通过亲和纯化细胞中的特异性蛋白质，直接将其置于EM网格上进行单颗粒冷冻电镜研究，还可能研究生理和病理蛋白质状态。

在过去的40年中，单颗粒冷冻电镜技术已经从球状物学(blobology)发展成为一种常规的、功能强大的原子结构测定方法。这项技术的普及不仅吸引了更多的用户，也吸引了来自不同领域的人才，从物理学、材料科学、数学到机器学习。新思想的注入和圈子的扩大预示着单颗粒冷冻电镜的未来将更加光明，它充满了方法的发展、合作，以及最重要的—美妙的生物新发现。

本文源自微信公众号：老千和他的朋友们

原文标题：《单颗粒冷冻电镜技术：历史与未来》

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