总结：本文详细介绍了冷冻电镜（Cryo-EM）的定义、发展历程、核心技术分类（含冷冻透射电子显微镜Cryo-TEM与冷冻传输扫描电镜Cryo-SEM），深入阐述了 “为何需要冷冻样品”（避免化学固定与脱水导致的结构破坏、保存含水样品原始状态）、不同冷冻技术的适用场景（如Cryo-TEM用于二维/三维研究，含单颗粒分析、冷冻断层扫描等；Cryo-SEM用于表面及断裂面观察），以及技术面临的三大核心挑战（样品冷冻保存、电子束敏感性、信噪比差）与应对方案（如快速冷冻防冰晶、低剂量/低电压成像、专业转移设备控温防凝霜）。
读者可系统学习到冷冻电镜的技术原理与实操关键要点，了解如何根据研究目标（如生物细胞、病毒、材料微观结构）选择适配的冷冻电镜技术，为开展含水样品高分辨率结构分析（从分子到细胞水平）提供科学的技术参考与问题解决思路。
1 冷冻电镜简介
冷冻电镜（Cryo-EM）是指观察冷冻样品的电子显微镜，其目的是在尽可能接近原始状态下观察样品的结构，特别适用于含水的样品。因此，Cryo-EM已成为研究生物样品的重要表征工具。
近年来，“冷冻电镜“一词已用于结构生物学研究的冷冻透射电子显微镜（Cryo-TEM），如无特殊说明，一般指Cryo-TEM。实际上，冷冻电镜还包含冷冻传输扫描电镜（Cryo-SEM）技术。
20世纪30年代，在Ernst-Ruska开发出第一台电子显微镜后不久，Ladislaus Marton意识到，使用这种显微镜研究生物样品时，“强烈的电子轰击会破坏有机细胞“。他建议需要开发新的样品制备技术，比如对样品进行冷冻。
第一台Cryo-EM是由Humberto Fernández-Morán在20世纪50年代开发的，但样品经常由于冷冻过程中形成的冰晶而造成对样品的损害。Taylor和Glaeser在1970年代中期的研究表明，冷冻后的样品提高了抗电子束辐射损伤的能力。直到20世纪80年代，当Jacques Dubochet找到了一种快速冷冻样品而不形成冰晶的方法时，现代Cryo-EM才诞生。
2 为什么要冷冻？
所有生物体的主要成分是水。事实上，至少70%可能是水，它参与了生命的许多过程。即使在最简单的生物体内，任何时候都有无数的动态过程在进行。这些使得生物样品不适合在电子显微镜下观察。显微镜内的真空和电子束带来的损伤，意味着不可能观察活的生物体。
为了保存用于电子显微镜检查的生物体，样品通常被固定和脱水。不幸的是，这些化学过程会引起生物体的结构变化。固定剂的交联将导致一些物理变化，而通过脱水去除水分将导致大幅度收缩。
然而，冷冻的水，也就是冰，可以在电子显微镜下观察到。所以，冷冻过程是需要防止或限制冰晶形成，那么含水样品的保存质量就要求很高，才可以在电子显微镜下观察到这种冷冻状态。
由于这种理想的保存方式，冷冻电镜可以观察的对象从细胞到病毒，从食品到聚合物，并提供了一种高分辨率观察生物结构的方法，甚至在分子水平上。
A.大肠杆菌在室温下通过化学固定、脱水和树脂包埋处理后用重金属染色。B. 嗜肺军团菌通过快速冷冻，在Cryo-TEM中观察，仍处于玻璃化状态。
A中的结构显示了许多由这种处理方式引起的人工假象。外膜和浆膜难以辨认，而且外观非常皱褶。周质的肽聚糖材料在加工过程中大部分被溶解。细胞核的DNA已经沉淀成粗大的链状物。
在B中，膜清楚地显示出真正的直线双层的外观，周质仍然是完全完整的。类核体的DNA很难看到，因为它是由填充在无核糖体区域的细小支架组成的。由于B的样品中缺乏重金属，所以对比度很低。图片由昆士兰大学的Rick Webb和墨尔本大学的Debnath Ghosal提供。标尺是100纳米。
3 使用哪种冷冻技术
在回答这个问题前，我们首先得问，我们是需要TEM还是SEM？在TEM中，电子束是穿透样品传输的，所以可以看到该样品的内部信息。不幸的是，电子束的穿透力非常差，因此被限制在非常薄的样品上。SEM可以观察样品的表面。
Cryo-TEM可以涉及到二维或三维研究。二维工作通常涉及单一的图像，以获得有关结构的信息。像细菌和病毒这样的小样品可以被整体观察，但较大的样品需要用冷冻超薄切片机进行切片，或用Cryo-FIB进行减薄。通常情况下，从这种类型的研究中可以获得足够的信息用于中等分辨率的研究。
三维工作可以针对分子、细胞或细胞器水平。冷冻断层扫描通常应用于细胞项目，以研究细胞器的结构及其相互之间的关系，并可应用于整个小样品，如细菌。较大的样品将需要进行减薄。子断层图平均法利用断层图内的信息来获得结构的分子分辨率。这项技术的重要性在于它能在细胞内的原生环境中获得分子结构。
另外两种结构生物学的Cryo-TEM技术可用于研究细胞外的分子结构。单颗粒分析使用纯化的分子颗粒样品，而MicroED利用感兴趣的小分子晶体。两者都能够产生远低于3Å分辨率的三维重构。
通过单颗粒分析重建的GroEL分子图。A. 侧视图。B 俯视图。图片由新南威尔士大学的Nick Ariotti提供。
对于三维研究来说，在冷冻电镜中实际获取图像只是项目的一部分，对产生的数据的分析才是工作的主要部分。
冷冻电镜对于研究任何含水样品都很有用。这些可以是生物样品，但也可以包括化妆品、食品、凝胶和聚合物。虽然Cryo-SEM主要是一种观察样品表面的技术，但对样品进行断裂会产生一个新的表面，并可以对内部结构进行研究。虽然许多Cryo-SEM研究只需要低分辨率，但如果有合适的设备和样品制备，就有可能获得分子分辨率，尽管这种类型的工作通常会使用Cryo-TEM来完成。
冷冻电镜技术的最大缺点是它们需要使用昂贵的专业仪器来进行样品冷冻和观察。优异的高性能计算能力也是必要的，特别是对于Cryo-TEM研究。
可用于不同类型的生物样品Cryo-EM成像和分析的样品制备技术比较
4 冷冻的挑战
冷冻电镜技术并不是一个简单的过程，它在工作流程的各个阶段都面临一些挑战：样品冷冻、样品转移和样品成像。
如前所述，冷冻电镜结果的质量只有在原始冷冻状态时才会好。如果冷冻效果不好，有冰晶形成，破坏了超微结构，那么实际上继续对该样品进行成像就没有什么意义。俗话说，“垃圾进，垃圾出“。
当然，一个项目所要求的冷冻质量与工作所寻求的结果密切相关。对于研究大分子结构，追求高分辨率的Cryo-TEM来说，冷冻的质量不能有任何的妥协。然而，对于分辨率要求不高的Cryo-SEM，类似Cryo-TEM的冷冻水平是没有必要的，特别是由于SEM成像通常只是样品的表面，那里的冷冻质量会好得多。
任何冷冻工作流程中的第二个挑战是将样品从冷冻固定装置中放入冷冻显微镜中。这里有两个主要问题：
1 确保样品不升温，因为升温将导致冰晶的再结晶，会损伤样品。
2 防止在试样表面形成冰霜或冰晶。只要试样暴露在空气中，即使环境湿度很低，也几乎会立即发生凝结。
为了缓解这些问题，可以将试样放在液氮下，在液氮正上方的干氮气层中进行操作，或者在真空下进行工作。由于部分工作流程中经常需要进行空气转移，因此在这段时间内，试样需要被一个护罩所覆盖，这是一个在样品上滑动的金属罩，可以吸引大部分的冰霜形成。一旦在真空下，这个罩子就可以滑回来，然后样品就会暴露在清洁的条件下。商业仪器可随时用于Cryo-TEM和Cryo-SEM系统，以解决冷冻转移的问题。
电子显微镜成像本身也有许多挑战。其中最重要的一点是，对于生物样品而言，电子束本身会有很大的破坏性。在电子束与样品的相互作用中，所发生的能量损失，特别是来自非弹性散射电子的能量损失，会沉积在样品中。这种能量强大到足以打破离子和共价键。产生的热量也很可观，会导致样品升温。
使用低电子剂量以防止电子束损伤意味着成像效果通常很差，因为信噪比（SNR）很低。如果不使用重金属染色剂，信号也很低，因为电子束与样品的相互作用不是那么强烈。
生物样品的电导率非常差，这也会导致Cryo-TEM和Cryo-SEM的样品损坏。在接近液氮的温度下观察样品可以减少辐射损伤的问题，它也减缓了样品中水的升华。对于Cryo-SEM，使用低电压会有帮助，特别是在荷电效应问题上。
参考资料
1.https://myscope.training
2.Glaeser, Robert M. “How good can cryo-EM become?.” Nature methods 13.1 (2016): 28-32.
3.Egelman, Edward H. “The current revolution in cryo-EM.” Biophysical journal 110.5 (2016): 1008-1012.
4 Issman, L., and Y. Talmon. “Cryo‐SEM specimen preparation under controlled temperature and concentration conditions.” Journal of microscopy 246.1 (2012): 60-69.
本文源自微信公众号：老千和他的朋友们
原文标题：《我们为什么需要冷冻电镜Cryo-EM？》
原文链接：https://mp.weixin.qq.com/s/4LhSQP2DjakjM5M8YrhGiw
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