一、背景介绍
在创新生物活性小分子的探索之旅中，构建具有独特结构的化合物始终是关键所在。其中，含有多个立体中心的复杂手性分子，无疑是化合物库拓展的宝贵财富。然而，传统的有机合成方法在获取这类分子时往往面临重重困难。如今，研究人员另辟蹊径，报道了一种极具潜力的生物催化过程，专门用于获取特定的手性胺非对映异构体。
借助分子对接技术，研究人员精准锁定了关键氨基酸残基。在此基础上，他们依据结构引导诱变策略，对还原性氨基酶（RedAm）进行巧妙改造与精心设计。经过改造的工程酶 RedAm（IR-09 W204R）展现出卓越性能，能够从外消旋酮 2（rec -2）高效生成（S，S，S）-异构体 3，转化率高达 45%，且 ee（对映体过量）值达到 95%（见图 1、2）。紧接着，通过钯催化的脱烯丙基化反应，手性伯胺 4 顺利生成，产率高达 73%。
这种工程生物催化剂已成功应用于制备规模，堪称进一步工程优化与工艺开发的绝佳起点，有望为药物设计领域带来全新变革。
图1 外消旋酮到单一构型手性胺的反应设计
图2 基于分子对接和残基突变改造的工程酶的生物催化过程
二、研究内容
在酶活性筛选过程中，研究人员获得的高立体选择性酶系（IR-09）仅能生成反式中间体3。为了实现图2所示的生物催化过程，研究人员采用结构引导的诱变策略，对还原性氨基酶（RedAm）进行工程化改造，旨在使其具备高动力学选择性((S,S)-2)和高立体选择性((S,S,S)-3)。
IR-09的晶体结构为鉴定活性位点残基提供了重要依据，这些残基在确定活性位点中发挥着关键作用。在晶体解析过程中，N-环丙基环己胺被用作助晶分子，其主要作用是辅助解析酶的活性位点结构。由于N-环丙基环己胺的结构比化合物3更小，研究人员利用AutoDock Vina进行了柔性对接。在对接过程中，距离底物5埃以内的氨基酸残基被允许自由旋转，以便更好地研究配体构象和氨基酸残基的相互作用。如图3所示，a为IR-09、助晶分子和辅酶的三元复合物条带结构；b为复合物的二聚体条带结构；c为以配体分子化合物3为中心的结合构象和活性口袋的氨基酸残基；d为c图的不同旋转视角图。通过对结合模式的深入分析，研究人员确定了底物结合位点中影响底物取向的关键氨基酸残基：W204、M233和Q234（见图3）。
基于上述分析，研究人员通过氨基酸定点突变和饱和突变策略，成功获得了高顺式选择性突变体IR-09 W204R。该突变体在催化反应中表现出优异的性能，转化率高达45%，ee值达到95%。进一步地，生成的中间体3通过钯催化的脱烯丙基化反应转化为手性伯胺，产率高达73%。
图3 IR-09的晶体结构和活性口袋的关键氨基酸残基。
三、研究意义与启发
总体而言，通过定点突变、饱和突变对酶的关键活性残基进行改造，显著提升了酶的立体选择性和立体特异性，进而成功实现了具有动力学分辨率的还原性胺化反应。这一研究不仅证明了工程酶在制备规模上仍能保持高水平的转化效率和选择性，还充分展现了其巨大的发展潜力。此外，该研究也凸显了分子对接技术在指导工程酶改造中的重要作用，为未来相关领域的研究提供了宝贵的参考和启示。
https://doi.org/10.1021/jacs.3c07010