Applying HT-SAXS to chemical ligand screening

前言

在临床治疗或研究中，常通过小分子化合物调节分子靶点的活性或结构，以治疗某些疾病，例如DNA损伤和修复领域（DNA polymerase theta，Mre11 nuclease et al）。研究这些化学分子与分子靶点的相互作用机制具有重要意义，HT-SAXS则是一种其他研究方法的有效补充，能够提供分子配体与靶点结合后整体的结构变化信息。本文所荐读的文章“Applying HT-SAXS to chemical ligand screening”是Methods in Enzymology期刊出版的《Small Angle Scattering Part B:Methods for Structural Interpretation》的第十一章内容(DOI:10.1016/bs.mie.2022.09.022)。作者为The University of Texas MD Anderson Cancer Center的John A. Tainer。此工作使用HT-SAXS screening 和微量热泳MST技术研究了Apoptosis-Inducing
Factor 与96个化学分子复合物的相互作用，验证了HT-SAXS screening方法的可行性。

1. HT-SAXS技术优势

相较于X射线衍射等其他方法，溶液SAXS的优势在于，能够灵敏地观测到生物大分子在溶液状态下的动态变化，例如一些柔性体系、天然无序蛋白（IDPs）、protein-protein interfaces (PPIs)、核酸等。结合同步辐射设施光源的光通量与实验条件，能够实现高通量样品实验条件筛选优化以及样品制备。

2. 研究内容与方法

本文使用Microscale
Thermophoresis (MST)热泳和HT-SAXS ，从96个复合物库中识别筛选配体和变构效应物，从而验证了HT-SAXS用于化学分子药物筛选的有效性。化学分子的靶点目标为Apoptosis-Inducing Factor (AIF) 凋亡诱导因子——一种线粒体氧化还原开关，与NADH（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）结合和还原时变构二聚。二聚化的AIF，支撑线粒体的二硫化物输入通道，并调节呼吸复合物进行氧化磷酸化(OXPHOS)的生物过程。

2.1 实验技术路线

2.2 数据分析

作者使用了SAXS数据计算了I(0)、Rg、V_R这三个参数，用于评估实验中，化学配体与靶点结合后的SAXS数据结果。其中V_R的物理意义为两条SAXS曲线的差异——当曲线完全相同完美匹配时，两条曲线每个q值点比率R(q)为1，则整个q范围内V_R为0。同时，使用公式计算Z因子，以评估V_R分辨率——当Z因子在0.5-1.0时可认为对照样品和参考基线之间有良好区分。

µ为2-3次重复实验V_R的平均值，σ为标准差

在本工作中，选择在低q和中q区域计算V_R，其对应为单体–二聚体信号差异最大、信噪比最高的区域。结果如下表：

	Monomer	Dimer
I(0)	22.6±1.1 Å	51.8±1.7 Å
Rg	28.9±0.9 Å	43.2±0.8Å
V_R	2.3±0.2	8.0±0.1
Z-factors	0.71	0.64

V_R的计算方法来自（Nature Methods volume 10, 453–454
2013），公式为：

其中q_i的强度比值。其计算过程如下图：

2.3 实验方法

通过设计小规模预实验，以确定实验方法的可靠性，并获得一些参数的参考值。样品测试使用商业化标准96孔板为样品载具，每个样品用量仅需要30微升。每个96孔板上，需要同时设置平行组、样品组、背景对照组。实验时，制备相同的平行样品，用于MST和HT-SAXS实验。

2.4 实验结果

MST方法从分子片段库中筛选出了25片段，其选择标准为response amplitude高于背景DMSO三个标准偏差。HT-SAXS实验不但对MST无法检测到的配体分子做了补充筛选，也被用于分析筛选出的14个亲和性最高的片段对AIF构象的影响。

如下图所示，Kratky-plot显示AIF-A8有少量的二聚化。而具有高亲和性的片段不会引入可被检测到的二聚。因此，SAXS能够有效地从MST筛选出的AIF配体中，选择出具有变构效应的片段。

3. 结论

本文所介绍的HT-SAXS的筛选方法能够为传统配体结合研究提供独特的、补充的信息；HT-SAXS结合MST，能够识别凋亡诱导因子配体之间潜在的变构效应。

未来，通过优化HT-SAXS样品加载系统，可进一步减少样品体积和浓度，未来探测器硬件和分析算法的改进，有望扩展HT-SAXS化学筛选的通量、灵敏度和分辨率，成为一种可靠而实用的方法。

本文源自微信公众号：科学边角料

原文标题：《同步辐射小角散射技术原理及应用》

原文链接：https://mp.weixin.qq.com/s/g0uiWtvXwF1kzCZpHWzsnQ

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高通量SAXS方法用于药物筛选

Applying HT-SAXS to chemical ligand screening

前言

1. HT-SAXS技术优势