圆偏振荧光光谱仪CPL测试原理、测试方法、样品应用与数据分析

圆偏振荧光光谱仪（CPL）是研究物质手性发光特性的核心仪器，可定量分析荧光分子的手性结构、构象变化及分子间相互作用，广泛应用于手性材料、生物分子（如蛋白质、核酸）、药物研发等领域。以下从测试原理、常用方法、样品要求、常见问题及数据分析五个维度展开详细说明：

圆偏振荧光的本质是手性荧光分子在激发后，发射的左圆偏振光（LCPL）与右圆偏振光（RCPL）强度存在差异，这种差异反映了分子的手性特征。其核心原理可拆解为3步：

激发过程：

用线偏振光（或圆偏振光）激发手性荧光样品，样品中的荧光基团吸收光子后，电子从基态（通常为手性构型）跃迁至激发态。由于分子手性的存在，激发态电子在左、右圆偏振光对应的能级上分布不均衡。

发射过程：

激发态电子通过辐射跃迁回到基态时，会发射荧光。由于激发态能级分布的不均衡，发射的左圆偏振荧光强度（Iₗ）与右圆偏振荧光强度（Iᵣ）产生差异，即形成圆偏振荧光。

信号检测与量化：

仪器通过偏振片、波片（如1/4波片）分离左、右圆偏振荧光信号，由检测器分别记录Iₗ和Iᵣ，最终通过不对称因子（gₑₘ，也称手性荧光因子）量化CPL信号强度，公式为：

根据样品状态、研究目的及仪器配置，常用测试方法可分为以下几类：

1.稳态CPL测试（最常用）

目的：测量样品在平衡状态下的CPL光谱（荧光强度-波长-偏振态关系）及gem值，分析分子的静态手性特征。

测试流程：

设定激发波长（通常选择样品的最大吸收波长，避免激发光干扰荧光信号）；

扫描荧光发射波长范围（从激发波长+20nm开始，避免瑞利散射）；

交替检测左、右圆偏振荧光信号，计算每个波长下的Il、Ir及gem

输出CPL光谱（Il−Ir随波长变化）、总荧光光谱（Il+Ir随波长变化）
及gem光谱。

适用场景：手性材料的手性表征、药物分子的手性纯度分析、生物分子的构象研究（如蛋白质二级结构）。

2.时间分辨CPL测试

目的：分析CPL信号随时间的变化（即激发态寿命内的手性动态变化），研究分子激发态的构象弛豫、分子间相互作用（如配位、组装）的动力学过程。

关键参数：除gem外，还需测量“时间分辨gem(t)及激发态寿命（t）。

适用场景：荧光分子的激发态手性演化、超分子组装的动态过程、生物大分子的构象变化动力学。

3.变温/变浓度CPL测试

目的：通过改变测试温度或样品浓度，探究环境因素对分子手性的影响（如温度诱导的构象转变、浓度依赖的组装行为）。

测试要点：

变温：需搭配控温样品池（如石英比色皿+控温套），温度范围通常为-80~150℃（需避免样品变性或溶剂结冰）；

变浓度：需配制一系列浓度梯度的样品，排除浓度淬灭或聚集导致的gem偏差。

适用场景：热敏性手性材料、超分子凝胶的组装-解组装过程、生物分子的热变性研究。

4.偏振依赖CPL测试

目的：分析激发光偏振态（线偏振/圆偏振）对CPL信号的影响，探究分子的跃迁偶极矩方向与手性的关系。

适用场景：手性发光材料的定向排列研究（如薄膜、液晶）、分子跃迁偶极矩的空间分布分析。

样品的纯度、状态及制备方式直接影响CPL信号的准确性（避免假阳性或信号淹没），具体要求如下：

1.样品类型与状态

2.浓度

需兼顾“足够的荧光强度”与“无浓度淬灭”——通常荧光分子浓度为10－⁶~10⁻⁴−mol/L（生物样品如蛋白质浓度为0.1~10μmol/L）；若浓度过高，会导致荧光自淬灭，使gem值偏低。

荧光量子产率（Φ）：Φ需≥0.01（弱荧光样品的CPL信号易被噪声淹没）；若Φ过低，需通过样品修饰（如引入荧光基团）提升荧光强度。

3.纯度要求

无荧光杂质：样品需纯化（如柱层析、重结晶），避免杂质的荧光信号干扰（尤其是手性杂质会导致假阳性）；

无手性污染：容器（如离心管、比色皿）需为非手性材质（避免玻璃器皿的手性吸附），实验操作中避免接触手性试剂（如手性溶剂、手套上的手性油脂）。

4.其他注意事项

溶剂选择：优先使用低粘度、低折射率的溶剂（如正己烷、甲醇），高粘度溶剂（如甘油）会影响分子运动，可能改变gem；

氧气影响：易氧化的样品需通惰性气体（如N₂、Ar）除氧，避免氧化导致的荧光淬灭或手性破坏。

CPL数据的核心是光谱特征提取与手性信息解读，需结合“定性分析”与“定量分析”：

1.基础数据处理（预处理）

背景扣除：扣除溶剂的CPL信号（空白对照）及仪器背景（如检测器暗电流），避免背景噪声干扰；

信号平滑：若CPL光谱波动较大（噪声高），可采用“移动平均法”或“Savitzky-Golay滤波”平滑数据（注意：平滑强度需适中，避免掩盖真实信号峰）；

归一化：将gem值归一化到总荧光强度（Il+Ir）），消除“荧光强度差异”对

比较的影响（如不同浓度样品的gem对比）。

2.定性分析：从光谱特征解读手性信息

CPL峰位置与强度：

CPL峰通常与总荧光峰的位置一致（若不一致，可能存在激发态构象转变）；

CPL峰的正负反映手性构型（如D-型分子与L-型分子的CPL峰符号通常相反）。

峰形与分裂：

单峰：说明分子手性构型单一（如单一构象的手性小分子）；

多峰/分裂峰：可能存在多种手性构象（如蛋白质的α-螺旋与β-折叠共存，对应不同CPL峰）。

3.定量分析：关键参数计算与应用

4、数据可视化与报告

必选图表：

总荧光光谱（Il+Irvs波长）：展示样品的荧光发射特征；

CPL光谱（Il−Irvs波长）：展示圆偏振荧光的信号峰位置与强度；gem光谱（gemvs波长）：直观呈现手性荧光的波长依赖性；

报告内容：需注明测试条件（激发波长、温度、浓度、溶剂）、空白对照结果、关键参数（gem、Φ、τ）及误差范围（通常重复测试3次取平均值，误差≤10%）。

本文源自微信公众号：科研测试站

原文标题：《圆偏振荧光光谱仪CPL测试原理、测试方法、样品应用与数据分析》

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